PCR试剂盒的选用及质检.pptVIP

中山大学 中山医学院生物化学教研室 达安基因公司 首席科学家朱振宇 教授、博士生导师Tel020   　  PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分变性、退火、延伸三步。经过若干循环后使目的DNA得以迅速扩增。 PCR技术自1989年开始被应用于临床检验以来，以其快速、简便、灵敏等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点.目前，临床PCR检验已经广泛使用商品化、规范化的试剂盒 ● PCR试剂盒的质量对测定结果的影响是直接而 且是至关重要的 ● 试剂盒的质量不但受到生产过程中质量控制 诸要素的影响，原材料的质量、方法学设计、包 装、运输和贮存等一系列的环节，都对试剂盒的 质量有决定性的影响  ● 如何选择质量好的且符合自己实验室要的试剂盒？  ● 如何保证拿到手里的试剂盒具有好的质量? 　　　　PCR或RT-PCR试剂盒的组成  ●核酸提取试剂   ●核酸扩增或反转录－核酸扩增试剂   ●产物检测试剂 　影响PCR试剂盒质量的因素    ●标本处理（核酸提取）方法、用于核酸扩 增的原材料及方法学设计   ●运输和贮存中所存在的问题 　　　　　核酸提取方法 ●经典方法：酚－氯仿抽提法，提取效率高、纯度好，但过程繁琐，易增加标本间相互污染的机会  ●简便方法：煮沸裂解法、玻璃粉或硅吸附法等 核酸提取除了要求操作简便外，更重要的是提取的效率及纯度，因此煮沸裂解法已被核酸纯化方法替代。 核酸提取的效率及纯度的检测 使用已知阳性（包括病毒含量）的溶血和血清标本，用试剂盒提供的标本处理方法提取核酸后扩增检测，与无溶血和脂血的血清标本比较，观察测定结果的差异，从而判断提取方法的优劣。 核酸扩增所需的原材料  ●寡核苷酸引物　 ●扩增缓冲液  　 ●dNTP  　 ●Taq酶以及反转录酶等 寡核苷酸引物和探针  ●引物和探针纯度对试剂盒的质量的影响 纯度的高低可根据260/280吸光度比值来判断，如小于2.0，则需重新纯化  ●引物和探针的结合特异性 应减少假阳性或假阴性的出现  　　　　扩增缓冲液和dNTP  ●缓冲液包括：Tris-HCL(pH8.3~8.8)，KCl或NaCl ，酶保护剂如小牛血清蛋白、明胶、Tween20或DTT ● Mg2+ ，过高或过低镁离子浓度均不利于扩增 ●四种dNTP的终浓度应相等 　　　　Taq酶以及反转录酶   ●酶浓度太高，则会出现非特异扩增；过低时，则靶序列产量很低 。  ●每100μl反应液中含1～2.5U（比活性为20U/pmol）Taq DNA聚合酶为佳 产 物 检 测  ●杂交固相：通常为聚丙烯微孔板和硝酸纤维素膜，其质量高低直接影响产物的测定   ●标记物：最常用的是辣根过氧化物酶（HRP） 试剂盒的运输和贮存●贮存：核酸扩增部分－20℃，产物检测部分试剂则应贮存于2～8℃ ●有效期:在适当的贮存温度下，PCR试剂盒的一般为6个月   临床PCR试剂盒的分类 ●临床PCR试剂盒按其测定目的可分为定性和定量测定两大类  ●前者主要是用于未知病因患者的临床病因诊断  ●后者则是用于已知患者治疗的动态观察 目前国内用于定性测定的PCR试剂盒的测定模式主要有PCR－ELISA和PCR－膜上杂交（杂交流）和分子信标荧光检测等；用于定量测定的试剂盒的测定模式则主要有TaqMan和Amplisensor荧光定量以及PCR－Elisa定量等 临床PCR试剂盒的选用原则 ●参考实际生产厂家的信息广告  ●参考同行对有关试剂盒的使用效果  ●参考有关机构的综合评价 如何选择适用的试剂盒 ●根据使用目的的选择  ●根据所在实验室的技术特点选择  ●根据所在地区患者的承受能力选择 临床PCR试剂盒的质检  ●内外包装的检查（厂家名称、检测目的、批准文号、批号和有效期等)，内包装的检查主要是看试