pierce生物技术在分子生物学与蛋白质组学中的应用.pdf

欢迎各位同行一起学习交流 和分享PIERCE在分子生物学 PIERCE 和蛋白质领域的成功经验! Pierce生物技术在分子生物学 Pierce生物技术在分子生物学 和蛋白质组学中的应用 和蛋白质组学中的应用 Marketing Technical Department Fisher Biosciences 王世春 PIERCE PIERCE Technical Focus: Technical Focus: 有机合成，化学偶联，表面化学和分析化学 Product Focus： Product Focus： 分子生物学：各种化学发光Blotting,EMSA,RPA 蛋白质组学：蛋白抽提, 蛋白定量,纯化,样品制备，功能研究以及各种染色 试剂和预染Markers 免疫学 ：抗体制备, 纯化，片断化, 分型和修饰 交联化学：交联剂，修饰试剂，生物素化试剂… 1.Western Blotting的问题与对策 1.Western Blotting的问题与对策 2.蛋白质提取,染色和定量 2.蛋白质提取,染色和定量 3.蛋白质样品制备之高效透析，一步脱盐，超 3.蛋白质样品制备之高效透析，一步脱盐，超 级浓缩及RED 级浓缩及RED 一.Western Blotting的问题与对策 一.Western Blotting的问题与对策 Western Blotting方法选择 Western Blotting方法选择 检测系统比较 检测系统比较 检测方法 检测方法 影响Western blotting成功的要素 影响Western blotting成功的要素 常见问题分析与对策 常见问题分析与对策 Western Blotting方法一: 直接法 Western Blotting方法一: 直接法 优点： 优点： 1.快速（一种抗体） 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非 2.没有二抗交叉反应引起的非 特异性条带 特异性条带 缺点： 缺点： 1.免疫反应性降低 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便 Western Blotting方法二: 间接法 Western Blotting方法二: 间接法 优点： 优点： 1.免疫特异性不受标记影响 1.免疫特异性不受标记影响 2.信号放大,灵敏度高（多个二抗结 2.信号放大,灵敏度高（多个二抗结 合位点） 合位点） 3.多种标记的二抗可供选择 3.多种标记的二抗可供选择 4.可选择不同的Marker 4.可选择不同的Marker 缺点： 缺点： 1. 交叉反应引起的非特异性条带 1. 交叉反应引起的非特异性条带 2.额外的二抗孵育以及条件优化 2.额外的二抗孵育以及条件优化 两种常用检测酶系统的比较 两种常用检测酶系统的比较 HRP （辣根过氧化酶) AP （碱性磷酸酶） 大小 40Kd 140Kd 最佳酶活性 PH：5 －7 PH：8 －10 酶活和二抗特异性 好于AP 抑制剂 氰化物， 氰化物， 硫化物 砷