用半定量RT-PCR法分析基因表达水平的影响因素.docVIP

用半定量RT-PCR法分析基因表达水平的影响因素 贵州农业科学2009,37(8):28~30 GuizhouAgriculturalSciences [文章编号31001—3601(2009)08—0510—0028—03 用半定量RT—PCR法分析基因表达水平的影响因素 陈名红,陈毅坚,叶艳青,苏源,李成云 (1.云南民族大学化学与生物技术学院,昆明650031;2.云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制 教育部重点实验室,昆明650201) [摘要]半定量逆转录聚合酶链式反应(Sem._QRT_PCR)以其灵敏,简捷及特异性高等优点已逐渐成为分析基因表达 水平的一种有效手段.着重对用半定量RT-PCR法分析基因表达水平的相关影响因素进行了综合论述,并讨论了半定量 RT-PCR法在基因表达研究方面的应用潜力. [关键词]半定量逆转录聚合酶链式反应;基因表达;影响因素 [中图分类号]S188[文献标识码]A TheFactorsAffectingAnalysisofGeneExpression LeveIbySemi.QRT.PCRTechnique CHENMing—hong,CHENYi-jian,YEYan-qing,SUYuan.,LICheng—yun. (1.TheSchoolofChemistryandBio-techniqueofYunnanNationalitiesUniversity.Kunming,Yunnan 650031:2.KeyLaboratoryofTheMinistryofEducationalforAgro-biodiversityandPestsControl,Yunnan AgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan650201,China) Abstract:Semi—QRT-PCRisarapid,simpleandhighlyspecificmeansinanalysisofgeneexpressionlevelinrecent years.ThispaperdescribesfactorsaffectinganalysisofgeneexpressionlevelbytheSemi-QRT-PCRtechnique comprehensively.andalsodiscussesthepotentialapplicationoftheSemi-QRT-PCRtechniqueingeneexpressionresearch. Keywords:Semi—QRT-PCR;geneexpression;influencingfactor 高等生物基因表达的变化是调控细胞生命活动 过程的主要机制,通过比较不同类型细胞或同一类 型细胞在不同生理状态下或在不同生长发育阶段的 基因表达差异,可为分析生命活动过程提供重要信 息.半定量逆转录聚合酶链式反应(semi—quantita— tivereversetranscriptionandpolymerasechainre— action,Semi—QRT—PCR)是近年来常用的一种灵敏, 简捷及特异性高的基因表达水平的检测方法[1],其 原理就是将总RNA逆转录成cDNA,然后扩增目 标cDNA和内参cDNA,根据PCR产物量将目的基 因的量除以内参的量的比值计算样品中mRNA的 相对数量[{].与经典的检测基因的表达方法如 Northern印迹,RNase保护分析,原位杂交及S1核 酸酶分析等相比,半定量RT—PCR法具有灵敏度高 (比杂交法高1000～10000倍),专一性好,快速简 便,所需样品量少及耗费较低等诸多优点.然而,已 有的研究表明,由于用半定量RT-PCR法分析基因 表达水平的影响因素较多[6.,导致该法目前只能用 于粗略比较样品问的基因表达水平.因此,如何控 制影响半定量RT-PCR准确性的因素以提高半定 量RT-PCR法的可靠性是相关研究者需共同面临 的课题.为全面掌握半定量RT—PCR方法,提高基 因表达水平的分析能力,有必要对用半定量RT— PCR方法分析基因表达水平中的相关影响因素加 以综合分析. 1提取组织总RNA 1.1组织材料的预处理 在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得 到全长的RNA,而实验失败的主要原因是RNA酶 的污染.在实验中,一方面要严格控制外源性RNA 酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的 RNA酶L8].由于样品离开活体或原来的生长环境 后,样品中的内源性的RNA酶即开始降解RNA, 降解速度与RNA酶含量及温度有关.因此,样品 取材后应立即置于液氮中速冻,然后可以移至一 7O℃冰箱保存.RNA酶极为稳定且广泛存在,其可 耐受多种处理而不被灭活,如煮沸