目的基因的制备幻灯片.pptVIP

以 mRNA减法杂交为例，基本原理是，从表达目的基因的组织中提取mRNA并反转录为cDNA, 然后与无目的基因表达的组织中提取的 mRNA做过量杂交，在两种组织中均表达的基因产物形成 cDNA/mRNA双链杂交分子，而特异mRNA反转录的cDNA片段仍保持单链状态, 将这种单链cDNA分离出来即为 差异表达的序列。 * 第二节 目的基因的分离 * 3.2.2 基因组DNA减法杂交 可以用来分离缺失突变基因。此法的不足之处是只适于具有较大缺失突变体的基因分离。 A 从野生型生物体制备总DNA，用一限制酶切割成小片段。同时从缺失突变生物体制备总DNA，经超声波随机切割之后，用生物素进行标记供作驱使DNA探针。 B 取大大超量的该种探针，与经酶切的野生型总DNA(称为测试DNA)片段混合，经变性、复性处理后，绝大部分的无标记的野生型DNA分子同标记的突变体驱使DNA探针杂交。 * 第二节 目的基因的分离 * C 将杂交反应混合物通过生物素结合蛋白质柱，大部分野生型的DNA分子因与突变型的生物素标记的驱使DNA探针杂交而结合到柱上，而野生型中特定的DNA片段B, 由于在突变型DNA中缺失了相应的片段，故没有相应的标记的探针与之杂交，经洗脱流出。 D 将洗脱收集的DNA同超量的标记探针再次杂交，经过多次重复富集之后，便可克隆到该特异片段。 E 最后用Southern杂交法进一步鉴定，如果该片段B同野生型DNA杂交而不能与突变型生物体DNA杂交，则证明该片段确实为缺失片段。 * 第二节 目的基因的分离 * 4 利用差示分析法分离目的基因克隆 4.1 mRNA 差别显示技术 (mRNA differential display by PCR， DDmPCR) 差别显示反转录PCR (differential display reverse transcription PCR ，DDRT- PCR) 是一种分离、鉴定差别表达基因的方法,具有与PCR技术相似的简单、快捷和高效等特点。 * 第二节 目的基因的分离 * 4.1.1 mRNA 差别显示技术的原理和基本程序 以mRNA为模板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA。 真核生物体mRNA的poly(A)上游的两个碱基有12种可能的排列组合。可以设计总共12种不同的下游引物，合成第一链cDNA。这种引物通常称为3’端锚定引物，它是由11～12个连续的脱氧核苷酸加上两个3’端锚定脱氧核苷酸组成，并用5’T11MN或5’-T12MN通式表示(其中M为除了T以外的任何一种核苷酸, 而N则为任何一种核苷酸，故MN共有12种不同的排列组合方式) 。这样，每一种此类人工合成的寡核苷酸引物，都将能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。 * 第二节 目的基因的分离 * 5’- T T T T T T T T T T M N -3’ 以mRNA:cDNA为模板，以一种由10个核苷酸组成的5‘端随机引物(20种)和3’端锚定引物(12种)组成的全部240组引物对作PCR扩增,可以获得20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定的mRNA种类。这个数字大体上涵盖了在一定的发育阶段某种类型细胞中所表达的全部的mRNA种类。 * 第二节 目的基因的分离 * 在PCR反应中加入放射性核素35S或32p标记反应产物。反应后,进行变性聚丙烯酰胺胶凝胶电泳，经放射性自显影在同一胶板上进行不同样品间比较，找出差异表达条带并回收差异条带，利用该片段制备探针进行cDNA文库或基因组文库的筛选，以分离该差异片段对应的全长cDNA或完整基因。 * * * * 随机-锚定引物PCR的产物电泳比较 不同组织的240组引物组合PCR产物在测序胶中电泳。 选择有差异的带，进一步PCR作探针。 筛选文库，找到差别基因的全长序列。 4.1.2 过程总结图 对照系组织细胞 * 第二节 目的基因的分离 * 总RNA 被诱导细胞 差异条带回收，克隆入载体 与3‘引物和5’引物进行PCR 总RNA 以5’T11MN为引物反转录 mRNA:cDNA杂合子 PCR扩增 PCR产物进行聚丙烯酰胺变性凝胶电泳 放射自显影 Northern杂交鉴定差异条带的真实性 差异条带的序列分析 从基因组文库或cDNA文库中获得cDNA全长或基因全长 进行基因功能鉴定 4.2 代表性差别分析(representation difference analysis, RDA) 代表性差别分析技术的基本原理或核心内容是：充分发挥了PCR以指数形式扩增双链模板，以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体的复杂度和多次更换cDNA两端接头引物等方法，达到克隆基因的目的。 * 第二节 目的基因的分离 *