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活细胞中的单个分子行为 ——生命科学中的单分子研究 张幼怡 北京大学第三医院血管医学研究所 分子心血管学教育部重点实验室（北京大学） 单分子研究方法: 直接观测单个分子的性质、分布及其动态行为 揭示被大量分子系综(平均)抹去或隐蔽的信息 经典的生物学研究方法: 对分子集合体（系统）在一定测量时间内的平均行为的研究 Ensemble Individual Molecules Limitation of conventional biochemical study methods  基本研究内容 个性研究 单个颗粒特征及行为 个体运动规律 个体自身结构变化规律 个体与群体关系研究 个体的聚集、排列构成功能系统 个体与同类或异类个体、群体的联系 时空关系 介质的作用 微观技术研究操纵 粒子的捕捉、移动、排布、固定 局部剪切、修补 生物单分子研究的历程 Single Molecules Beginning in vitro molecular motors, DNA transcription … Now in living cell virus, receptors … Future in vivo organism, animal, even human 生命科学中的单分子研究 生物分子的物理学研究 体外 结晶 结构 隧道显微镜 原子力显微镜 X线衍射等技术 细胞内生物单个分子的实时检测 在体 实时动态 动力学过程 相互作用 操纵 荧光显微镜 生物原子力显微镜 Funatsu et al. Nature 374, 555 (1995) R. Yasuda et al., Nature 410, 898 (2001) Visualization rotation in F1-ATPase 1994年 Abrahams 牛心线粒体F1-ATPase的晶体结构， 证实了 Boyer 提出的ATP合成酶催化机制：结合－变构模型，为此获得诺贝尔化学奖。 1997年Noji H , Adachi K 研究小组等利用单分子荧光偏振（smFP）获得关于取向的动力学过程 荧光标记的肌动蛋白丝作为一种标志物和ATP合成酶g亚基结合。F1-ATPase和埋在膜内的F0（质子运送单元）组成H+-ATP合成酶。 在细胞呼吸和光合作用中可逆地将跨膜质子流与ATP合成/水解偶联起来。在有ATP时，从膜上方可观察到荧光标记的肌动蛋白丝反时针方向转动。 Adachi等进一步说明旋转是分步进行的，每步旋转120?, 证明这种分步运动是F1-ATPase的固有性质，亦即每个ATP分子水解驱动g亚基转动，而且这种运动与g亚基上的负载无关 2004年，用高时间分辨率摄像，进一步观察ATP酶每步旋转120?内实际包括一个80?以及一个40?的小步伐。改变ATP浓度，步伐发生改变。 分子马达 Xiaowei Zhuang et al. Science 288, 2048 (2000) 四膜虫（Tetrahymena）核酶 诺贝尔物理奖获得者朱棣文小组对核酶（ribozyme）单分子的折叠研究 P1端（识别螺旋）与基质S成对结合，Cy3标记基质S，Cy5标记在5’端。 S 可以进入靠近Cy5处的结构（称为docking），或者从该处解离出来（undocking）。此时Cy3 和Cy5荧光供受体对由于距离改变，能量传递也随之变化，用spFRET可以检测到随机的docking/分离过程。 这一研究的重要意义在于观察到一种核酶快速折叠的中间态的存在，是单分子谱研究的一个里程碑。 A single-molecule study of RNA catalysis and folding 生命科学中的单分子研究 生物分子的物理学研究 体外 结晶 结构 隧道显微镜 原子力显微镜 X线衍射等技术 细胞内生物单个分子的实时检测 在体 实时动态 动力学过程 相互作用 操纵 荧光显微镜 生物原子力显微镜 细胞的体积小 细胞内的生化反应速度快 生物活性分子的含量低 不具有传统检测方法所熟知的典型物理化学性质 活细胞天然荧光背景偏高 荧光标记分子光漂白时间不够长 四维高分辨率实时示踪技术难以实现 特点与难点 对活细胞内生物单分子的研究手段的基本要求 实时、快速、 高灵敏度、 高时空分辨率、 无损或微损检测 基本技术要求