二sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质.pptVIP

实验二 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 (1) 学习SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。 (2) 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。 实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N—甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成。利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。 在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁移率取决于它所带的净电荷的多少、分子的大小和形状等因素 。 如果用过量的还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇等）和十二烷基硫酸钠（缩写SDS）加热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键将被还原，蛋白质-SDS复合物具有相同的电荷密度，并引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率不再受原带的电荷和形状的影响，而取决于相对分子质量的大小，电泳时纯粹靠凝胶的分子筛效应进行分离。 Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。 化学法的引发剂是过硫酸胺（Ap），催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。 采用不同浓度的Acr、Bis 、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。 这次实验是利用SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大肠杆菌全蛋白。 SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续系统中进行；包括浓缩胶（积层胶）和分离胶。 材料与试剂 1．材料： 标准样BSA（小牛血清白蛋白）,已经与上样缓冲液混合完毕 2．试剂 1）30%(Acr)/0.8%N,N-甲叉双丙烯酰胺（BIS） 2）5×SDS电泳缓冲液,稀释成1× 3）Tris-HCl/SDS,浓缩胶pH 6.8 4）Tris-HCl/SDS,分离胶pH 8.8 5）10%过硫酸铵(AP) 6）TEMED 商品试剂 实验步骤 1．装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。 2．制分离胶：按所需的浓度配制12.5％分离胶。 TEMED最后加，快速混匀后用移液枪灌胶，由固定位置灌入，注意不能有气泡； 灌完分离胶后在胶面上小心加1毫升水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限） 30%Acr-Bis Tris-HCl pH 8.8 H2O 10%AP TEMED 5ml 3ml 4ml 120? l 20? l 3．制浓缩胶：按所需的浓度配制4%的浓缩胶，配方如下： 30%Arc-Bis Tris-HCl pH 6.8 H2O 10%AP TEMED 400ul 750ul 1800ul 50ul 7.5ul 4. 灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入电泳槽内,加入电泳缓冲液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整理。 5．加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样7.5?L。 6．电泳：先恒压80V，待样品进入分离胶后，调电压为120V（恒压）。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，停止电泳。 7．翘开玻璃板，将浓缩胶切掉, 剥下凝胶，准备染 色。 8． 凝胶染色：使用考马斯亮蓝R250染色。两块胶（小盒子）或四块胶（大盒子）同步染色脱色。盖上盖子用微波炉加热约15-20秒，摇床振荡15分钟，回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脱色液（25%乙醇，7.5%乙酸）脱色，用量和步骤与染色相同，脱色两次，每次10分钟。 注意事项 (1) Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩。 (2) 玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。 (3) 样品槽模板梳齿应平整光滑。 (4) 灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。 (5) 切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。 (6)电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。 (7) 稀释5×SDS/电泳缓冲液至1×浓度灌入电泳槽，需800毫升。 移液枪的使用方法 移液器量程的调节 使用干净的枪头 移液器的使用手法，两档位 吸液 放液 去枪头的方法 1.将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触