第一章 电泳技术.pptVIP

第一章 电泳技术 王 英 第一节 电泳技术的基本知识 一、定义 电泳—带电粒子在直流电场中向着电性相反的电极方向移动的现象。 电泳技术—利用电泳现象进行物质分离的技术。 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面) [器材和试剂] 1.器材 （1）醋酸纤维薄膜（8×2mm） （2）点样器 （3） 染色皿，漂洗器，镊子 （4） 722型分光光度计 （5）电泳仪：直流电源，水平电泳槽 2.试剂 （1）巴比妥缓冲液（pH8.6 I=0.06） （2）氨基黑10B染色液 （3）漂洗液：95%乙醇、冰醋酸、H2O （4）洗脱液：0.4mol/L NaOH [操作] 1.将电泳槽置于平台上。将缓冲液注入电泳槽两边的电极槽内,液面的高度要一样。 2.在醋纤膜一端欲点样处作好标记，然后将薄膜放在缓冲液中让其自然浸润（10分钟）。 3．将充分浸透（膜上没有白色斑痕）的薄膜取出，用滤纸吸去膜上过多的缓冲液。 4．用加样器蘸取染色血清（约5ul）,垂直印在CAM粗糙面上，待样品全部渗入薄膜内后，移开点样器。 点样： 用点样器蘸上一层血清，于膜的粗糙面距膜边端2厘米处点样，使血清全部渗入膜内。 5．电泳 （1）加样后，将薄膜条架于支架两端，粗糙面（点样面）朝下，点样侧置于阴极端，膜两侧分别搭上滤纸，滤纸一端垂入缓冲液中。薄膜应位正，平直无弯曲，加上槽盖后即可电泳。 （2）正确连接电泳槽与电泳仪对应的正负极。开启电源通电。电压10~15V/cm。电泳40~60分钟，泳动距离约达3.5~4cm时即可断电。 6.染色 后断电，用镊子取出薄膜条投入染液中5~10分钟，染色过程中不时轻轻晃动使染色充分。 7．漂洗 从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂洗皿中反复漂洗，直至背景染液漂尽为止。此时清晰可见5条色带。 8.定量 （1）洗脱比色：将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0.4mol/l NaOH 4ml,于37℃水浴20分钟（不时振荡），待颜色脱净即用波长620nm比色，以空白管调零读取各管吸光度。 （2）计算 吸光度总和（T）=A+α1+α2+β+γ（吸光度） ? 思 考 题 名词解释 1.迁移率 2.电渗 3.电泳 问答题 1.血清蛋白电泳的基本原理是什么？ 2.影响电泳迁移率的因素有哪些？ 3.CAME分离血清蛋白电泳时应注意哪些问题？ 第三节 凝胶电泳 凝胶电泳主要分为： 聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳， 琼脂糖凝胶电泳主要应用于核酸的分离纯化， 聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于蛋白质和小分子核酸、 1、机械强度高，透明 2、原料成分纯度高，制凝胶的重复性好 3、凝胶孔径可调 4、化学稳定性和热稳定性好 5、电渗作用小 6、电泳分辨率高 第二节 醋酸纤维素薄膜电泳 本实验以醋酸纤薄膜为支持物，利用血清中蛋白质颗粒的等电点大部分小于7，在pH8.6的缓冲液中带负电荷，在电场中向正极移动，电泳后根据血清蛋白移动快慢，可依次分为清蛋白、球蛋白的α1、α2、β、γ五个区带，染色后显出清晰色带。 — + 白蛋白 α1 α2 β γ 加样 69000 200000 300000 90000~150000 156000~300000 4.8 5.06 5.06 5.12 6.85~7.5 白蛋白 α1－球蛋白 α2－球蛋白 β－球蛋白 γ－球蛋白 相对分子质量/Mr 等电点（pI） 蛋白质名称 血清蛋白的等电点及分子量 （+） （-） 2cm 也可光电扫描定量 — + 白蛋白 α1 α2 β γ 加样 临床意义 正常值： 白蛋白： 57～72% α1球蛋白：2～5% α2球蛋白：4～9% β球蛋白： 6.5～12% γ球蛋白： 12～20% 急性肝炎：发病早期蛋白质电泳无变化，发病两周后白蛋白、α2及β球蛋白减少，γ球蛋白增高。 慢性肝炎：γ球蛋白升高，白蛋白下降较急性肝炎显著。 肝硬化：白蛋白、α1、α2球蛋白均明显下降，γ球蛋白极度升高，甚至A/G比值倒置。 肾病综合征时，白蛋白降低，α2 、β球蛋白升高。 醋酸纤维薄膜电泳的优点： 简便、快速、样品用量少、应用范围广、分离清晰、没有吸附现象等。