重大科学研究计划课题报告生物分子高效分离与表征研究组.doc

国家重点基础研究发展计划（重大科学研究计划）课题年度报告 项目编号：2012CB910600 项目名称：蛋白质定量新方法及相关技术研究 课题编号：2012CB910601 课题名称：高效低残留的蛋白质样品处理和分离新材料 2012年12月1日 年度计划执行情况 年度计划完成情况 按照项目任务书要求本课题在2012年度主要针对蛋白质定量中蛋白质或肽段回收率低、分离峰容量低和基质非特异性吸附强的问题，侧重于发展低残留的磁性材料、整体材料、蛋白质均衡器固载基质以及超细粒径分离材料。按项目任务书的规定，完成了研究内容和预期目标。 在低残留的样品预处理新材料方面：1）研究了基于原子转移自由基聚合反应（ATRP）在磁性微球材料表面键合可控链长的聚合物链段的方法，探索了不同长度和种类的链段与蛋白质在材料表面残留间的关系，制备了新型的亲水性刷型聚合物磁性纳米颗粒，并将其用于大规模分析人血清糖蛋白质组，共鉴定到106个糖蛋白的204个糖基化位点；2）研究了基于可逆加成-断裂链转移自由基聚合(RAFT)制备可控链长的聚合物微球材料的方法，并结合蒸馏沉淀聚合制备了一种新型表面硼酸基团可控的核壳结构的聚合物纳米材料，实现了蛋白质的高选择性富集；3）分别以分子印迹材料和硼酸为高选择性配基，以点击化学为键合方式，制备了核壳卫星型高选择性配基修饰的磁性材料；4）发展了基于三磷酸腺苷配基的固定化金属离子磁性纳米材料，用于磷酸化肽富集和定量，将其检测限降至3amol，且17条磷酸化肽段和2条磷酸化蛋白质具有显著差异。4）基于比大表面积的石墨烯，研制了C8修饰的三明治结构介孔石墨烯复合物，并用于内源性肽段的富集，在鼠脑组织中选择性地富集到89个内源性肽段；5）研制了石墨烯/二氧化钛复合材料，用于磷酸化肽段的选择性富集，对磷酸化肽的检测限可以降至2×10-9 M；6）研制了具有等级孔结构的含钛磷酸铝5型分子筛介孔材料，并将其成功用于磷酸化肽的高选择性富集。 在蛋白质均衡器技术方面：发展了基于噬菌体展示单链可变区片段文库（scFv@M13）为配基的蛋白质均衡器，并将其用于血清蛋白质组样品，经均衡器处理血清后，鉴定蛋白数目大幅上升，从280个提高到560个，展示了该蛋白质均衡器在高丰度蛋白质去除和低丰度蛋白质富集方面、以及提高蛋白质组鉴定覆盖率方面的重要作用。 在蛋白质组样品分离材料方面：1）制备了粒径分布较窄、粒径可控（1μm-2μm）的亚2μm核壳结构硅胶色谱填料基质，并实现了多肽的快速分离；2）采用苄基甲基丙烯酸酯和硅氧烷为原料，通过“一锅法”制备了苯基-硅胶杂化整体柱，杂化整体柱的最小理论塔板高度为8.38 μm，对应的理论塔板数为119,000 理论塔板数/米，对六种蛋白的酶解产物进行了分离分析，计算得到12cm苯基-硅胶杂化整体柱的峰容量为144；3）通过一步升温的改进型“一锅法”制备了两亲性的有机-硅胶杂化整体柱，对肽段混合物进行分离，均取得了很好的分离效果，最高柱效可达到110,000理论塔板数/米；4）基于“巯基-烯烃”的点击化学反应这一新型固定相键合方式，设计了新型的两性离子亲水作用色谱固定相，该固定相不仅具有优异的分离选择性和分离效率，还克服了常用亲水作用色谱固定相化合物适用范围窄的问题；5）基于水平共聚的技术，发展了反相/弱阳离子交换（C18/WCX）的混合模式色谱固定相，在不同pH条件下，C18/WCX柱与C18的正交性优于商品化C18固定相的正交性。 在本年度，发表文章27篇，其中SCI收录26篇，申请发明专利4项；培养博士6名，硕士7名。 研究工作的主要进展 2.1低残留的样品预处理新材料方面 1）表面链长可控的蛋白质样品预处理聚合物纳米颗粒材料 通过ATRP反应，在纳米颗粒表面共价键合链长可控的刷型聚乙二醇（PEG）层，然后在聚合物链段末端嫁接亲水性的麦芽糖，从而制得新型的亲水性刷型聚合物磁性纳米颗粒由于活性/可控聚合物链段上有大量活性位点的存在，材料表面麦芽糖的键合密度为单分子层接枝麦芽糖的16倍。将该材料用于糖肽富集，灵敏度可达到500 amol的水平，较常用的硼酸富集法和点击麦芽糖亲水作用色谱法的灵敏度提高了2个数量级。在大规模分析人血清糖蛋白质组中，共鉴定到106个糖蛋白的204个糖基化位点。 通过结合RAFT和蒸馏沉淀聚合（DPP）技术制备了一种新型表面硼酸基团可控的核壳结构的聚合物纳米材料：以亚甲基双丙烯酰胺（MBA）和甲基丙烯酸（MAA）二元共聚物为核，亚甲基双丙烯酰胺和3-丙烯酰胺基苯硼酸（AAPBA）二元共聚物为壳的纳米颗粒材料（poly(MBA-co-MAA)@(MBA-co-AAPBA)）并用于实现糖蛋白质的选择性富集（图1）。由于核壳层中均含有MBA单体，因此具有很强的亲水性以及水相分散性，可以降低材料的非