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蛋白质和氨基酸测定 学习目标 1.了解蛋白质和氨基酸的性质 2.明确蛋白质和氨基酸测定方法 2.掌握凯氏定氮法测定蛋白质的过程及注意事项 3.了解氨基酸的性质和测定方法 蛋白质和氨基酸测定内容 1. 概述 2. 凯氏定氮法 3 .蛋白质的快速测定法 4. 氨基酸总量的测定 5. 氨基酸的分离与测定 1. 概述 (1)蛋白质的生理功用及在食品中的作用 （2）食品中的蛋白质含量 （3）蛋白质系数 （4）蛋白质水解 （5）蛋白质测定方法 (6)氨基酸的测定与分离方法 2. 凯氏定氮法 原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。 食品中的蛋白质测定 原理、过程及试剂 消化——蒸馏与吸收——滴定 消化----浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾 蒸馏----氢氧化钠 吸收----硼酸 滴定----盐酸、混合指示剂 消化 蒸馏与吸收 消化液 + 40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。 滴定 用盐酸标准溶液 滴定至终点. 然后进行计算. 微量凯氏定氮装置 蛋白质测定仪------消化、蒸馏吸收 蛋白质测定仪---滴定 KDN型蛋白质测定仪 QSY-Ⅱ型蛋白质测定仪  3 .蛋白质的快速测定法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。 新开发的：双缩脲法、 紫外分光光度法、 染料结合法、 水杨酸比色法等。 下面简单介绍双缩脲法 1. 原理 脲（尿素）NH2—CO—NH2 加热至150~160℃时，两分子缩和成双缩脲。 方法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。 4. 氨基酸总量的测定 （一）甲醛滴定法 （二）茚三酮的比色法 （一）甲醛滴定法 1.原理：氨基酸本身有碱性 —NH2— 基，又有 酸性 —COOH 基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，甲醛与 —NH2— 结合，碱性消失，再用强碱来滴定 —COOH 基。 2．适用范围：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况及食品中游离氨基酸的测定等。 3．试剂： ① 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。 ② 0.1%百里酚酞乙醇溶液， ③ 0.1%中性红50%乙醇溶液， ④ 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。 4．操作：同时取两份样： 一份中加中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和样液中其它酸性物质。 另一份中加百里酚酞、中性甲醛用NaOH 滴，中和了样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和。 二者之差可计算氨基酸含量 （二）茚三酮的比色法 原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。 5. 氨基酸的分离与测定 （一）薄层色谱法 （二）氨基酸自动分析仪法 （三）气相色谱法 （四）高效液相色谱法 （一）薄层色谱法 原理： 取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。 Rf = a / b 操作方法： ① 薄层板制备 ② 样品液制备 ③ 点样 ④ 展开 ⑤ 显色 （二）氨基酸自动分析仪法 （三）气相色谱法 （四）高效液相色谱法 本章小结 1、重、难点及适用范围 凯氏定氮法测定蛋白质的过程及注意事项 2、了解仪器法测定蛋白质及氨基酸的方法 3、下次课做实验----实验要求 4、作业 * 2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%） ???????????????????????????????????????????????????????????????? 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应） 蛋白质分子中含有肽键 —CO—NH— 与双缩脲结构相