微卫星多重PCR扩增技术.pptVIP

* 鱼类育种学实验 内容：微卫星多重PCR扩增技术 实验目的 掌握SSR分子标记技术的原理与分析方法； 学习多重PCR技术，了解体系优化的方法； 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法； 掌握银染的实验方法。 实验一 PCR反应及体系优化 实验材料与仪器 材料：团头鲂DNA模板（浓度：100 ng/μl ） 仪器用具：PCR仪，制冰机，紫外反射投射检测仪，微量移液器，冰箱，天平，电泳仪，电泳槽，烧杯，量筒， 200 ul PCR管，Taq酶，dNTPs，引物，PCR缓冲液，石蜡油，电泳所需试剂，溴酚蓝，琼脂糖，硼酸，Tris碱，蒸馏水，离心管。 实验步骤 PCR反应液配置－PCR扩增－产物检测－程序优化－PCR扩增－产物检测－结果分析 多重PCR扩增体系为20 μl：包括100 ng基因组 DNA，1 × PCR 缓冲液，Mg2+ (1.5 mmol/L)，1 U Taq 酶，dNTPs 0.2 mmol/ L，多重PCR扩增体系内各位点上、下游引物分别为0. 25 μmol/L 1.2 1.2 Mg2+ 试剂 体积 三重PCR体系 (μl) 四重PCR体系(μl) H2O 13.7 13.2 Buffer 2.0 2.0 dNTP 0.4 0.4 Primer-1 (F/R) 0.25+0.25 0.25+0.25 Primer-2 (F/R) 0.25+0.25 0.25+0.25 Primer-3 (F/R) 0.25+0.25 0.25+0.25 Primer-4 (F/R) -- 0.25+0.25 Taq 酶 0.2 0.2 DNA (100 ng/μl) 1 1 Total 20 μl 20 μl 体系名称 引物组合 产物大小 3-7 Mam_EST811 290-320 Mam_EST129 200-250 Mam_EST64 140-170 4-5 Mam_EST179 360-400 Mam_EST11 290-330 Mam_EST90 200-250 Mam_EST37 140-180 PCR程序： 95 C 3 min 95 C 30 s Ta 30 s 32 cycles 72 C 45 s 72 C 5 min 4 C for ever 注：对Ta进行梯度优化，设置4个温度梯度－50，54，58，62。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 溶液配置： 5×TBE：54 g Tris 碱，27.5 g硼酸，20 ml 0.5 mol/L EDTA （pH 8.0），加ddH2O定容至1000 ml。 40％丙烯酰胺：380 g 丙烯酰胺，20 g甲叉-丙烯酰胺，加ddH2O定容至1000 ml。 0.5 mol/L EDTA （pH 8.0）：186.1 g EDTA?Na?2H2O，800 ml ddH2O，NaOH调pH至8.0 （about 20 g NaOH），加ddH2O定容至1000 ml，高压灭菌。 10％ APS：1 g APS，加ddH2O 定容至10 ml，置于4 C。 8% non-denaturing PAGE gel: 40% 丙烯酰胺 14 ml ddH2O 41 ml 5×TBE 14 ml 10％ APS 650 μl TEMED 65 μl 染色液－0.1％ AgNO3：0.5 g AgNO3，加ddH2O 定容至500 ml，置于4 C。 显色液：10 g NaOH，0.2 g NaCO3， ddH2O 定容至500 ml，置于4 C保存，用时加 2 ml 37％ formaldehyde。 固定液－10％冰醋酸 银染步骤： 1. 取下凝胶用去离子水冼胶2 min； 2. 0.1% 硝酸银染色10－15 min； 3. 弃去染色液, 蒸馏水洗胶30 s； 4. 显色液显色15秒, 换用新的显色液, 显清条带为止； 5. 显色后用固定液（冰乙酸）终止显色，2 min； 6. 用去离子水洗涤2遍。 作业 完成实验报告，分析检测步骤和结果，探索微卫星多重PCR优化程序的控制因素对反应的影响,分析SSR带型。 * * * * *