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1．高效液相色谱法与经典液相色谱法 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。 高速：是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。HPLC流量可达1-10ml·min-1.例如对氨基酸分离，用经典色谱法，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。 高效：是指分离效率比经典的液相色谱高。经典的液相色谱理论板数仅有2-50 m-1。由于HPLC应用了颗粒极细、规则均匀的固定相，柱效高。其理论板数可达104-105 m-1，故能实现有效的分离。 高灵敏度：应泛使用了高灵敏度的检测器大大提高了检测灵敏度。紫外检测器最小检测限可达10-9，而荧光检测器最小检测限可达10-12 高自动化：应用计算机处理数据、绘图、实行程序软件控制。 2．高效液相色谱法与气相色谱法 （l）HPLC不受试样挥发性和分子量的限制，可用于高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的有机物质的分析，还可用于无机离子的分析。气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。 (2)HPLC可用多种溶液作为流动相，选择余地大。流动相对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。而气相色谱采用的流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。所以HPLC法对于性质和结构类似的物质进行分离的可能性比气相色谱法大得多。 (3)HPLC法经常可在室温条件下工作，而气相色谱一般都在较高温度下进行的。 (4) HPLC法易于收集流出的组分，可用制备柱进行大量制备。 总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展，在色谱法中占有日益重要的地位，成为药物分析中不可缺少的一种分离手段。 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格及溶剂消耗多，这是它的主要缺点。 第三节 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的结构可分为四个主要部分： 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 此外还配有辅助装置：如梯度洗脱，自动进样及数据处理等。 1．高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。 要求：密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等。 类型：输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵：恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关； 恒压泵：是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差。 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。 2．进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 常用的进样器有二种： 1、隔膜注射进样器 2、高压进样阀：六通阀、双路进样阀等。 3 分离系统——色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它的作用是分离。它包括柱管与固定相两部分。 HPLC的色谱柱常用内壁抛光的不锈钢管，形状几乎全为直形。按主要用途分为： 分析型：柱长10～30cm，内径为2～5mm， 制备型：柱长10～30cm，内径20～40mm。 一般在分离柱前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离的性能不受影响。 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。 4．检测系统 检测器 是高效液相色谱仪的关键部件之一。它的作用是把色谱洗脱液中组分的量转变