noggin基因诱导骨髓基质干细胞分化为神经细胞的相关研究-周盛年精选.pptVIP

Noggin基因诱导骨髓基质干细胞 分化为神经细胞的相关研究 周盛年 山东大学齐鲁医院 1.造血干细胞 可以增殖并分化为其他血液细胞，能够重建宿主的血液系统.通过限制性分化过程，使其子代细胞逐渐成熟，产生红细胞、血小板、单核细胞、粒细胞等成熟细胞，不断补充血液细胞.一般认为在人体内CD34阳性细胞、鼠内为Sca1阳性细胞富含HSC。 骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells ,BMSCs)又称骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell ，MSCs ） 即是指骨髓基质系统中所含有的一类多能干细胞，它不表达造血细胞的相关标志，具有向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力。 骨髓基质干细胞特性 1.具有自我更新的能力和多向分化潜能，处在不同的微环境中能分化成多个细胞系,形成多种间充质细胞,包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等,特别是能够横向分化为神经细胞和胶质细胞。 2.BMSCs 具有易于获得、培养、增殖,多次传代后仍保持干细胞特性并能定向分化为所需细胞,移植后内能长期存活,诱发的免疫反应较弱等特点,并且可以促进胚胎干细胞和神经干细胞增殖和分化,在神经损伤修复、基因治疗、造血重建等实验和临床研究中皆具有良好的应用前景。 3. BMSCs 在体外可以大量扩增、自体移植可以避免免疫排斥反应和具有强大的可塑性. 4. 可作为多种疾病细胞替代治疗和基因治疗的载体,使BMSCs 成为当今生命科学领域研究的热点之 Noggin Noggin基因是1992年California大学的Harland ,R.M.和 Smith ,W.C.从非洲蟾蜍的胚胎中分离出来的。此后发现该基因在胚胎发育中有重要神经诱导作用，尤其是诱导外胚层的背侧发育；亦表达于出生后及成年哺乳动物中枢神经系统内，调控成年海马、室下区神经干细胞的增殖和分化，在学习和记忆的形成过程中有重要的作用 Noggin noggin基因是目前在体内与体外均被证实有神经诱导作用的神经诱导剂。其神经诱导功能主要是通过拮抗骨形成蛋白（bone morphogenetic protein-4,BMP4）的作用实现的。BMP可促进胶质细胞的分化而抑制神经发生，而noggin蛋白则促进神经发生 诱导 因骨髓基质干细胞有良好的可塑性，在外界诱导因子刺激下可分化为各类神经细胞。 目前一般有三种方法可以诱导分化BMSCs为神经细胞－抗氧化剂、生长因子和转基因诱导。在转基因诱导法中我们引入了Noggin基因――神经诱导基因。 课题思路 我们构建带有Noggin基因的载体，并将它转染到BMSCs中，预期它能够诱导BMSCs分化为神经细胞，并对分化后的神经元样细胞进行检测。在细胞形态、分子、基因、电生理水平均可证实为神经细胞 1.骨髓基质干细胞培养 用Percoll淋巴细胞分离液分离出大鼠骨髓基质干细胞，并用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养，胰酶消化传代，扩增大鼠骨髓基质细胞。显微镜下观察形态 2.扩增带有Noggin基因的表达载体 将构建好的带有目的基因Noggin的质粒转化感受态大肠杆菌株DH5α，挑菌落提取质粒后进行重组体测序鉴定。经酶切、PCR鉴定。 3.将带有Noggin基因的表达载体导入骨髓基质细胞内诱导其为神经细胞 取第四代、第六代BMSC，用脂质体转染法介导Noggin基因进入到骨髓基质细胞内。观察细胞形态的改变。 形态学观察 4.检测与鉴定 1.利用免疫细胞化学技术鉴定分化细胞是否表达神经细胞特异性标记; 2.利用RT-PCR技术检测部分参与神经细胞生理功能的基因. 3.利用膜片钳技术检测诱导后的神经细胞是否具有电生理功能。 1).免疫细胞化学技术 免疫荧光 2) RT-PCR 3)膜片钳技术 原理：膜片钳技术是以微弱电流信号测量为基础的，利用玻璃微电极与细胞膜封接，可测量多种膜通道电流，是一种典型的低噪声测量技术，可以说达到当今电子测量的极限 操作步骤 1微电极的制备 拉制 电极优化处理 电极充灌 2全细胞跨膜总电流的记录 施加正压 电极入水 高阻封接 破膜 预期结果 应用膜片钳技术对骨髓基质干细胞分化的神经元样细胞进行了电生理特性检测。 预期结果证实神经元样细胞具有活跃的电生理特性。且与骨髓基质干细胞的电生理特性有明显差异。 质疑和争论 骨髓基质细胞分化为神经细胞被认为是一种跨胚层发育，不少学者对细胞的这种跨胚层分化表示质疑，认为这是由于其他原因导致产生的一种假象。质疑与争论的焦点主要