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胶回收 -E．Z．N．A．Gel Extraction Kit 实验原理 回收柱（硅胶膜）在高盐、低PH值的情况下吸附DNA，在低盐、高PH值的情况下释放DNA。 我们知道原理，就知道了影响胶回收的几个影响因素，PH值、高盐试剂、低盐洗脱试剂。 实验步骤 1. RT-PCR的产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，紫外灯下观察。为防DNA损伤，避免长时间的紫外光照射。 2. 用刀片或凝胶尺切下含有所需DNA带的凝胶，置于1.5ml离心管中，称重。 3. 往离心管中加入胶重的等量体积的Binding Buffer（即每100mg胶加入100 ul Binding Buffer）. 4. 50℃水浴10分钟，使凝胶完全熔解，在水浴过程中每2~3分钟漩涡震荡混匀一次。 5. 将离心柱放入2ml收集管中，将上一步熔解的凝胶导入离心柱中，10,000g离心1分钟。弃残液。 6. 将离心柱重新放回收集管；加入300ul Binding Buffer，10,000g离心1分钟。 7. 弃去收集管中的液体，将柱子放回收集管，再加入700 ul SPW Wash Buffer，静置2-3分钟，10,000g离心1分钟。 8. 重复步骤7一次。 9. 弃去收集管中的液体，空柱放回收集管，再10,000g离心1分钟。 10. 将离心柱放入一个干净的1.5ml离心管，加入20ul去离子水到柱子内部中央，放置2分钟，离心1分钟。 收集管中的溶液即为已纯化的GAPDH基因DNA片段。 连接 1. 在微型离心管中制备下述连接反应液，全量为10 μl： pGEM-T Vector 0.5 μl GAPDH基因 3.5μl ligase 1.0μl 2×ligase buffer 5.0 μl Total: 10.0μl 2. 室温连接2小时，或者16℃连接过夜。 pGEM-T vector图谱 * pGEM-T vector有个T突出端，以rTaq催化扩增的PCR产物有个A突出端，二者依据碱基互补配对原则配对连接。 *