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分子育种在乳酸乳球菌中的应用综述 【摘要】乳酸乳球菌是一种“公认安全”的革兰氏阳性细菌，广泛存在于人、畜的肠道中并发挥许多重要的生理功能。随着生物技术的发展,人们对乳酸乳球菌基因表达及调控过程的认识不断深入并构建了一系列表达，成功地表达了许多外源蛋白，初步展示出良好的应用前景。主要对近年来分子育种在乳酸乳杆菌中的应用做简要综述。 【关键词】乳酸乳球菌、分子生物育种、宿主表达、改良生产 【正文】 1作为宿主表达外源蛋白 乳酸乳球菌是一种“公认安全”的革兰氏阳性菌，广泛存在于人、畜的消化道中并发挥着重要的生理功能。多年关于乳酸乳球菌的研究表明，它的新陈代谢相对来说比较简单,其生理、生化和遗传背景等也比较清楚[1]。乳酸乳球菌作为一种表达受体菌具有许多优势：主要只有蛋白Usp45分泌到细胞外,因此其产物的下游纯化过程相对简单;有些试验菌株只有一种输出性的蛋白水解因此可能得到无细胞外蛋白水解酶的突变菌株;此外,乳酸乳球菌在试验条件下很容易生长、繁殖。所以,乳酸乳球菌可作为外源蛋白表达的一种很好的受体菌。 1.1质粒 研究表明：乳酸菌质粒的功能包括乳糖的代谢、细菌素的合成、胞外多糖的产生以及DNA 限制修饰系统等。 质粒的获取可以参考任志娟[2]、曹建[3]、万谦[4]等人的相关研究， 重组质粒可参见张志发[5]等的相关研究，乳酸乳球菌作为表达载体构建重组质粒表达目的产物的应用很广泛，如构建南极假丝酵母脂肪酶[6]、OMPX[7]的表达载体等。 1.2乳酸乳球菌表达系统 1.2.1组成型表达系统 组成型启动子(constitutive promoter)是指在该类启动子的控制下,结构基因的表达大体恒定在一定水平上,在不同组织、部位表达水平没有明显差异[8]。用组成型启动子所构建的表达系统就是组成型表达系统，主要有nice系统[9]和P170系统[10]。 NICE系统乳链菌肽生物合成自身调节模型，即NICE系统，NICE系统已经广泛也应用于乳酸乳球菌中表达各种外源蛋白作为选择性标记，可参见相关文献[11]； P170表达系统已经应用于乳酸乳球菌的工业生产和发酵等过程，研究应用可参见相关文献[12]。 1.2.2诱导型表达系统 诱导型启动子(inducible promoter)是指在某些???定的物理或化学信号的刺激下,可以大幅度地提高基因转录水平的启动子。乳酸乳球菌的很多启动子都属于诱导型启动子,在特定的条件下，如抗菌素的攻击、温度或pH值的变化,或是加入特定的糖等都有可能诱导启动子从而启动功能基因的表达[13]，用诱导型启动子所构建的表达系统就是组成型表达系统。 2分子生物学技术改良乳酸乳球菌的生产 2.1食品级微生物 乳酸乳球菌作为食品级微生物[14]，不但在食品生产方面应用广泛，而且在治疗和预防疾病和促进人类的健康等方面有着广阔的前景[15] 乳酸乳球菌的表达产物乳链菌肽（Nisin）是由乳酸乳球菌产生的一种抗菌多肽，其对几乎所有的革兰阳性菌及其芽孢形成均具有较强的抑制和杀灭作用[16]。 Nison的结构性质[17]及相关研究[18]可参见相关文献，乳链菌肽是一种高效无毒的天然防腐剂，广泛应用于乳制品、肉制品、罐头制品、饮料类的保鲜中。 自然界中分离得到的 nisin 生产菌株生物合成 nisin量较低，达不到工业化生产的要求，必须通过菌株改良，提高 nisin 的产量。目前主要采用诱变和基因组重排两种方法[19]。 2.2诱变 为了获得高效价的Nisin生产菌株,采用传统的微生物育种技术,以Nisin生产菌乳酸乳球菌作为出发株,通过紫外照射和亚硝酸处理[20]进行协同诱变育种[21]。 2.3非诱变方法筛选 分子育种中基因组重排技术是以乳酸乳球菌诱变后获得的突变株为出发菌株，制备原生质体，并进行再生及灭活，采用基因组重排技术选育乳链菌肽高产菌株[22]。 再有采用基因工程改造的方法,将其乳酸脱氢酶进行敲除,并过量表达丙氨酸脱氢酶基因使丙酮酸主要生成丙氨酸提供能量,可提高Nisin的产量[23]。 3综述 传统的诱变育种方法存在诱变效率低、筛选工作量大、周期长、重复诱变过程造成一些无关的或负向突变的积累等缺点[24]，所以创新性的选育手段的出现无疑会对乳酸乳球菌的相关生产作出巨大的贡献。采用分子育种的相关技术，定向改造乳酸乳球菌，使其向着人们期望的方向发展，具有重大的社会和经济价值。 【参考文献】 [1]李芳、李永明、 徐子伟、 张磊，乳酸乳球菌作为基因工程受体菌研究进展，生物技术通报，2010-5 [2]任志娟、李轶杰、马正海，乳酸乳球菌质粒提取方法的改进与优化，新疆农业科学，2011-4 [3]曹健、吴兴泉，乳酸菌质粒提取方法及电转化条件的研究，2011-6 [4]万谦、曹健、吴兴泉、李艳芳、李凤娟、宋鹏，乳酸菌天然质