[工学]第2章 分子克隆工具酶.pptVIP

* * * * * * 二、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow fragment) （1）Klenow酶的基本性质： 大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。 Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→ 3’核酸外切酶活性。 （2）Klenow酶的基本用途（可被T4 DNA聚合酶代替）： 补平由核酸内切酶产生的3′粘性凹陷末端 抹平DNA的3′粘性凸出末端 DNA片段的同位素末端标记 cDNA第二链的合成 双脱氧末端终止法测定DNA序列 三、T4 DNA聚合酶(T4 phage DNA polymerase) （1）T4 DNA酶的基本特性： 有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3的DNA聚合酶活性。 在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切 －在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸。　 －在四种dNTPs均存在时，聚合活性占主导地位。 （2）基本用途 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 四、T7噬菌体DNA聚合酶(T7 phage DNA polymerase) 持续合成能力最强 有3’→5’ 外切酶活性是Klenow酶的1000。 可代替T7噬菌体DNA聚合酶的用途。 五、耐热性的DNA聚合酶（第八章详讲） 来自噬高温细菌，如Taq、Pfu等。 高温下具有5’→3’ DNA聚合酶活性，一般在72℃最理想。 有5’→3’ 外切酶活性。 具3’→5’ 外切酶活性者具校正（proofreading）功能，如Pfu。否则无校正功能，如Taq。 用于PCR扩增。 六、反转录酶(reverse transcriptase, RTase) 反转录酶是依赖于RNA的DNA聚合酶，以RNA为模板聚合cDNA链，具有5′→3′的DNA聚合酶活性、5′→3′的RNA外切核酸酶活性和RNase H活性，但缺乏3′→5′RNA外切核酸酶活性，所以反转录过程中无校正功能。 用于cDNA第一链甚至第二链的合成，构建cDNA文库、RACE、RT-PCR等。 AMV（禽源）适温42℃，、MMLV（鼠源）适温37℃ 。野生型反转录酶能双向外切降解DNA-RNA杂合链中的RNA链，基因工程可敲除其RNase H活性。 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 七、末端转移酶(terminal deoxynucleotide transferase, TdT) 是不依赖于模板的DNA聚合酶，催化dNTP加于DNA分子的3’羟基端。 可产生同源多聚尾用于连接、引物退火，也可用于末端标记。 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 第四节 其它分子克隆工具酶 一、依赖于DNA的RNA聚合酶 依赖于DNA的RNA聚合酶ATP（DNA dependent RNA polymerase）包括SP6噬菌体和T4噬菌体RNA聚合酶。 活性：转录活性，无需引物，但识别特异启动子序列。 用途：体外合成RNA分子作探针等。用于表达外源基因的mRNA，然后用于翻译蛋白。 二、DNA连接酶(DNA ligase) DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5′-磷酸根和3′-羟基生成磷酸二酯键。这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。 1、T4 DNA连接酶的作用机制： ①ATP + DNA ligase (E)→ E-AMP + PPi。 ②E-AMP上的AMP转移到DNA的5’磷酸根上，使其活化，释放出酶。 ③活化的5’磷酸根与相邻的3′羟基形成3’,5’-磷酸二酯键，并释放出AMP。 修复双链DNA缺口处的磷酸二酯键 修复与RNA结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键 连接多个平头双链DNA分子： 2、DNA连接酶的反应条件 Tris-HCl 50-100mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L ATP 0.5-1mmol/L DTT 5mmol/L Volume 10-20μL Temperature 4-25℃ (16℃ optimal) Time 4-16h 3、平头双链DNA片段的连接操作 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢的多。 提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）。 加大平头末端底物