[农学]9胚胎工程技术1 NXPowerLite.pptVIP

胚胎和配子生物工程(1)(Embryonic and gametal bioengineering) 陈从英 2009.10.16 9.1 概述 一、胚胎移植的含义 胚胎移植技术— ET（embryo transfer） 胚胎移植：将一头良种母畜（供体）配种后的早期胚胎取出，移植到另一头同种（受体）的生理状态相同的母畜体内，使胚胎继续发育成为新个体，俗称借腹怀胎。 2、胚胎移植的意义 ①、大大提高优良母畜的使用效率； ②、缩短世代间隔，大大提高品种改良的速度； ③、通过冷冻胚胎进口，可实现更有利的种畜遗传物质的跨国界交换； ④、有利于防疫工作； ⑤、可以克服不孕； ⑥、利用胚胎冷冻保存品种资源。 ⑦、是发展家畜生物技术重要的研究手段。 3、家畜胚胎移植的发展历史 ①、1890首次实现了兔的胚胎移植； ②、1934年成功地进行羊的胚胎移植； ③、50年代初羊、猪、牛的胚胎移植取得成功； ④、1964年在日本完成了世界上首次非手术牛胚胎移植并得到犊牛； ⑤、国外，1976年牛的非手术胚胎移植技术推广，1977年开始商业化应用； ⑥、在国内，牛胚胎移植在1978年实验成功，80年代后期到90年代初，奶牛胚胎移植开始在国内生产中应用。 四、牛胚胎移植的技术路线 １、供体牛和受体牛的选择 供体应具有相当高的育种价值(供体牛选择遗传性能和生产性能优良个体，而受体选择则重在健康的体质和正常的繁殖能力，供体牛一般为引进的优良个体，受体为本地牛；） 供体生殖机能应处于较高的状态：产后60天以上，无生殖系统疾病，体质强健 受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，体型中上等，非优良品种 受体健康状况良好，已进入发情季节 供受体发情时间应接近或一致。 ２、超数排卵和人工授精 PMSG+ PGF2а法： 在母牛发情期第8—12天，肌注PMSG 2000单位，48小时后，肌注15-甲基前列腺素 4mg。 发情后12小时进行第一次输精； 第一次输精后8小时进行第二次输精。 现在使用的超数排卵的方法一般为ＦＳＨ＋ＰＧ法； 具体操作方法为：在供体牛发情后的９－１２天，经检查黄体较好的牛，采用四天减量注射ＦＳＨ的方法； 羊：发情周期的第12-15天，促性腺激素处理的第二天或第三天，注射PG 牛超数排卵时间表 供体超排处理 供体母畜的配种 必须用优秀的种公畜进行多次配种，一般隔8-12小时进行一次配种，直到发情结束。 配种前应对种公畜的精液进行质量检查。 可优秀种公畜不足时，可考虑首次采用本交，以后采用人工授精，也可以全部采用人工授精。 供体配种 4.胚胎的收集 胚胎冲洗液的配制：杜氏磷酸缓冲液PBS，布林斯特液SOF合成输卵管液 手术法收集胚胎 输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚 子宫角冲胚 非手术法收集胚胎 二路法 三路法 3、胚胎回收（冲胚） ①牛胚胎回收（冲胚）：在牛发情后（发情之日计为第0天）的第七天采用非手术法回收胚胎。 ②一般供体牛每两个月超排一次，平均每次超排能获得可用胚胎6-7枚。在新疆的最高记录是一头牛一次超排获得48枚可用胚胎。 ③冲胚所用的液体为PBS液，其主要成分有： Nacl、Kcl、KH2PO4、Mgcl2.6H2O、Na2HPO4、丙酮酸钠、葡萄糖、牛血清白蛋白、青霉素、链霉素 ④无菌操作的重要性 移胚 配种后3天的供卵巢 供体羊胚胎收集 4.胚胎的检查 收集到的冲洗液静置，冲洗液分离。 拣胚：将胚胎移至培养液或保存液中。 胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、发育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚胎级别。 4、胚胎质量鉴定 牛胚胎大小直径约为0.15-0.16mm（第七天） 一般分为A、B、C三个等级 A级：胚胎形态完整，轮廓清晰，分裂球大小均匀，结构紧凑，无附着的细胞和液泡或很少； B级：轮廓清晰，色调及细胞密度好，可见到一些附着的细胞和液泡； C级：轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞和液泡较多。 6天收集的胚胎（未拣） 二细胞至四细胞胚胎 5.胚胎的保存 胚胎的降温：使胚胎停止发育，延长其体外生存时间 体外培养：将胚胎置于体温条件下，在培养液中，使其继续发育 胚胎冷冻：通过一定的处理程序，将胚胎降温冷冻后，保存于液氮中 6、胚胎冷冻 胚胎冷冻的难点： 冷冻液的毒副损伤 降温过程的冷冻损伤 三步平衡冷冻法 胚胎分别用含3%、6%、10%甘油且含10%牛血清的PBS液的保存液浸渍5分钟后，用含10%甘油的PBS 装管冷冻。 一步法冷冻 胚胎用含10%血清的乙二醇溶液平衡后直接冷冻 牛胚胎冷冻程序示意图 7、受体的同期发情处理 自然发情（妊娠率更高） 一次同期法（PG）（妊娠率较低） 两次同期法（