聚焦美妙的荧光荧光知识充电站-生物通.PDFVIP

聚焦美妙的荧光：荧光知识充电站 有了荧光，生物世界开始变得很美妙。由于只需物理方法（光照）即可检测，无需涉及化学反应， 亦无同位素的危险，荧光技术早已成为研究生物微观世界中最方便、最重要的示踪工具之一。生物通11 月聚焦绚丽多彩的荧光染料，为大家介绍常用的核酸染料、蛋白染料、细胞器染料以及荧光蛋白。在此 之前，我们有必要先了解一些荧光的基本知识。 荧光激发三部曲 第1 阶段：激发 能够发出荧光并能作为染料的化合物称为荧 激发光源如白炽灯或激光提供了光子能量 光基团或荧光染料。有的荧光基团本身不发光，可 hνEX 。荧光基团吸收能量后，到达单重激发态 却能特异高效地结合某类生物大分子，并在结合后 (S1)。此过程就将荧光和化学发光区别开来，因为 发出美丽的荧光，比如核酸染料；有的荧光基团本 后者的激发态是由化学反应引起的。 身可以在一定条件下发出荧光，我们需要将这个 第2 阶段：激发态的寿命 “ 明灯” 以特殊的方法“挂”在某些可“指路” 的生物大 激发态的寿命很短暂，通常只有1 到10 纳秒。在 分子上，使这大分子变成“指路灯”，可用于定位生 这段时间内，荧光基团经历了构象的改变，并与它 物标本中的特定区域或者示踪，这时我们通常称之 所处的分子环境发生了大量的相互作用。此过程有 为荧光探针。 两个重要的结果：第一，S1的能量部分损失，使 除了荧光染料，还有一类蛋白质能被激发出各 荧光基团到达能量略低的S1 单重激发态。第二， 种颜色的美丽荧光，常用于蛋白表达标签而作为示 并不是所有被激发的分子最终都通过荧光发射回 踪或者定量的工具，如大名鼎鼎的绿色荧光蛋白就 到基态（S0 ）。碰撞淬灭、荧光共振能量转移 是其中之一，这个生物通将在后续的文章中另作介 （FRET）等过程也会使S1 减少。 绍。 第3 阶段：荧光发射 美丽的荧光从哪里来？请看图1 的三部曲。 在这一阶段，荧光基团释放出光子能量hνEM，回 到基态S0。由于能量损耗，光子的能量减少，发 射波长总是大于其激发波长，两者之间的差值叫斯 托克斯位移（Stokes shift ）。在荧光分析中，就 是利用斯托克斯位移现象，将激发光与荧光物质的 发射光分离开来，只检测发射光，从而提高检测的 灵敏度和选择性。有些荧光色素的斯托克斯位移较 大，而有些荧光色素的斯托克斯位移较小。斯托克 斯位移越大，其激发光谱和发射光谱的重叠就越 图 1. 荧光激发过程的示意图。（摘自 少，有利于提高其分辨率。 Molecular Probes: The Handbook） 2009年11月26日第七十期 第 5 页，共 31 页