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以包含体形式表达的rGM-CSF分离纯化 Extraction and purification of inclusion body 含有从组蛋白质包含体的宿主细胞 搜集菌体细胞，并破碎细胞 离心，弃上清液 含有重组蛋白的沉淀 溶解的重组蛋白质 凝胶过滤 离子交换层析 吸附层析 重组蛋白质的复性 不溶物质 ①以缓冲液充分洗涤 ②加入强变性剂 ③加入还原剂 ④离心 图 1 纯化大肠杆菌包含体中的重组蛋白质的一般步骤 STEP 1 超声波破菌 STEP 2 包含体的洗涤 STEP 3 包含体中rGM-CSF的抽提 STEP 4 凝胶过滤色谱分离 STEP 5 rGM-CSF的复性 STEP 6 离子交换色谱纯化 以包含体形式表达的rGM-CSF分离纯化 STEP 1超声波破菌 发酵完毕，以4000r/min于4℃离心10min收集菌体。使用超声波仪破菌，选择一系列菌体浓度、超声强度和超声时间。镜检评价其破碎效果。 破菌原则：使大肠杆菌菌体破碎率尽可能高，又要保持包含体的完整性。 注意事项： 超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。 功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4℃左右，超声时保持冰浴。 菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。 可通过SDS电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 STEP 2包含体的洗涤 除去大部分杂质，目的蛋白的纯度达到85% 为进一步纯化提供有利条件 用0.5%的表面活性剂Triton X-100的TE缓冲液，悬浮洗涤30min 去除细胞碎片等杂质 用pH 8.3的TE缓冲液反复洗涤 去除沉淀包含体中的可溶性杂蛋白 以10000r/min于4℃离心30min 液固分离 STEP 3包含体中rGM-CSF的抽提 包含体由蛋白质分子之间相互作用形成共价或非共价缔合而成。 包含体溶解：加入变性剂破坏分子内或分子间的相互作用。 包含体中有各种错配的二硫键，需加入还原剂以解开二硫键。 还原剂：二硫苏糖醇（DTT） 变性剂：尿素、盐酸胍、SDS 价格低 适合各种色谱纯化 具体步骤：将抽提液与包含体混匀（100mL:1g），室温下搅拌30min后，以15000r/min于4℃离心26min，上清液即为rGM-CSF抽提液，于4℃存放。 STEP 4凝胶过滤色谱分离 凝胶过滤是分离包含体抽提物种变性蛋白的有效方法。 注意！ 上样前需要将包含体抽提物于37℃温育30min。 Why? STEP 5rGM-CSF的复性 STEP 6离子交换色谱纯化 THANKS~