[理学]PCR基因扩增.pptVIP

PCR基因扩增 一、实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术 二、实验原理 PCR是一种由引物介导的选择性体外扩增DNA的方法，由美国人B.Mullis于1983年发明 包括三个基本步骤: 变性（Denature）：目的双链DNA片段在94℃下解链 退火（Anneal）：两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃ 左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对 延伸（Extension）：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成 由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106 倍 1、PCR反应中的主要成份 引物 dNTP Mg2+ 模板 Taq DNA聚合酶 反应缓冲液 引物 PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定 引物设计和选择目的DNA序列区域时遵循下列原则： 引物长度约为16～30bp 引物中G+C含量通常为40%～60%，可按Tm＝4(G+C)+2(A+T)粗略估计引物的解链温度 四种碱基应随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发 引物3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对 在引物内，尤其在3’端应不存在二级结构 两引物之间尤其在3’端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量 引物5’端对扩增特异性影响不大，可引入酶切位点或突变位点 引物不与模板结合位点以外的序列互补 简并引物应选用简并程度低的密码子 引物的浓度一般为0.1～0.5μmol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，引物浓度偏低则降低产量 dNTP dNTP常用的浓度为20～200μmol/，而且4种dNTP的终浓度相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足而出现的错误掺入 dNTP浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误掺入率，同时会抑制Taq DNA聚合酶的反应活性；适当的低浓度会提高反应的精确度 注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系 Mg2+ Mg2+浓度会影响Taq DNA聚合酶的活性、真实性，影响引物退火、解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等 通常Mg2+浓度范围为0.5～2mmol/L 在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度 模板 PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，单链分子、双链分子、线状分子或环状分子均可以作为模板 DNA （线状分子比环状分子的扩增效果稍好） 模板的数量和纯度均会影响PCR结果：一般反应中的模板数量为102 ～105 个拷贝。模板拷贝数过多可能会增加非特异性产物 模板DNA中的杂质也会影响PCR的效率 Taq DNA聚合酶 早期PCR扩增是由大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段完成，但这种酶不耐热，所以每一轮循环在变性和退火后必须加入新酶 后来引入耐热的Taq DNA聚合酶，一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min，95℃ 40min，97℃ 5min，因此PCR中变性温度不宜超过95 ℃ Taq DNA聚合酶的最适温度是72 ℃，连续保温30min仍具有相当的活性，一次加酶可满足PCR反应全过程的需要 纯化的Taq DNA聚合酶有5’→3’外切酶活性，而无3’→5’外切酶活性，不具有Klenow酶的3’→5’校对活性，因此在PCR中有错误掺入率，大约是每2×104个核苷酸中有一个，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤为注意 Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30min掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。在100μL反应体系中，1.5～2U的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环 使用Taq DNA聚合酶浓度过高，可引起非特异性产物的扩增，浓度过低则扩增产物量减少 反应缓冲液 一般含100mmol/L Tris·Cl （20℃下pH8.3-8.8）, 500mmol/L KCl和0. 1％的明胶，有时候还有适当浓度的Mg2+ Tris·Cl是一种双极性离子缓冲液，主要靠其调节pH，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性 KCl有利于引物的退火，但浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性 明胶保护酶不变性失活 Mg2+影响Taq DNA聚合酶的活性，直接影响反应的特异性和扩增DNA的产率 反应液可加入5 mmol/L的二硫苏糖醇（DDT）或100μg/ml的牛血清白蛋白（BSA），它们可稳定酶活性 2、PCR反应参数 变性 退火 延伸 循环次数 变性 变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的 DNA双链会很快复性，