[生物学]DNA重组.pptVIP

第二章 DNA重组 一、DNA的组成和结构 二、天然DNA的制备 （一）天然DNA的来源和用途 （二） 天然DNA的提取 1、准备生物材料 选择生物种类；选择DNA易提取和含量高的组织；选择DNA得率最高的生长期。 大肠杆菌质粒DNA：应在对数生长期后期。 植物DNA：选幼嫩植株或黄化幼苗。 肝脏DNA：要清除胆囊。 2、裂解细胞 原核细胞：用溶菌酶， NaOH和SDS ，煮沸，冰冻，超声波等方法； 结构复杂的动、植物材料：先必须粉碎（液氮冻结后研磨，或捣碎机、研钵直接粉碎），再参照裂解原核的方法。 3 、分离和抽提DNA 提取总DNA：在裂解液中加适量酚／氯仿／异戊醇或氯仿／异戊醇等有机溶液，使DNA与蛋白质分开，用乙醇或异丙醇沉淀DNA，再离心。 提取叶绿体或线粒体等细胞器DNA以及病毒和噬菌体的DNA：须先从裂解液中分离完整细胞器、病毒和噬菌体，抽提前必须经DNase处理，水解附着于其表面的其它DNA。 除RNA：用RNase水解除RNA 分离抽提DNA最有效的方法：氯化铯梯度离心（氯化铯溶液中加适量溴化乙锭，紫外灯下DNA带和RNA带都发荧光，但沉降系数明显不同而聚集于不同的氯化铯密度区） 大肠杆菌源质粒DNA的提取 碱裂解法*原理： 根据共价闭合环状质粒DNA与染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0 ~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 λ噬菌体DNA的提取 溶源周期 溶菌周期 提取λDNA的原理： 先将溶源菌培养至一定密度，通过热诱导，使λDNA从宿主染色体DNA上释放出来，再经过溶菌周期培养，获得大量λ噬菌体，从中提取线形的λDNA。 提取过程： 溶源菌诱导培养 分离λ噬菌体 λDNA的提取 （三）DNA的纯化 1、氯化铯－溴化乙锭连续梯度离心法 2、离子交换层析法 3、琼脂糖凝胶电泳洗脱法 4 、“基因纯”试剂纯化 5、从DNA样品中去掉EB 6、乙醇沉淀法 （一） 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 限制酶的命名 2.Ⅱ型限制酶的特性 不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列； 各种限制酶的识别序列一般都具有回文结构(palindrome) 3.两种特殊的限制酶：同尾酶和同裂酶 5. 限制性核酸内切酶反应系统 反应系统包括：酶、底物、反应缓冲液、合适的反应温度等。 底物DNA 限制酶的催化效率与DNA样品纯度、DNA分子构型、识别序列两侧序列长短以及序列碱基甲基化等密切相关。 限制性核酸内切酶用量： 主要取决于酶本身的催化活性和底物DNA样品 酶活性单位（U）：某种限制性核酸内切酶在最适反应条件下，60 min内完全切割 1μg λDNA所需的酶活性。 酶活性高的用量少，反之则多。 能被高效切割的DNA样品用酶量少，反之则多。 等量的两种DNA样品，限制酶识别序列密度大的用酶量多，反之则少。 限制性核酸内切酶反应缓冲液 限制性核酸内切酶反应温度 大多数的最适反应温度是37℃，而少数酶的最适反应温度高于或低于37℃。 （二）、DNA分子片段化 天然DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的DNA片段，即DNA分子的片段化。常用的切割方法有单酶切、双酶切和部分酶切等方法。 单酶切法：用一种限制性内切酶切割DNA样品，最常用。 双酶切法：用两种不同的限制酶切割同一种DNA分子。 部分酶切：指选用的限制性核酸内切酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。 四、 特异性DNA片段的PCR扩增 A method to amplify specific genetic sequences. PCR Cycle （二）“长产物片段”和“短产物片段” “短产物片段”是严格地限定在两个引物链5’端之间的，正是需要扩增的特定片段；“长产物片段”则带有不需要的“尾巴”。 “短产物片段”是按指数倍数增加的