原位杂交组织化学常用试剂及处理杂交前准备一-中国试剂网.PDFVIP

中国试剂网 3.18.2 原位杂交组织化学常用试剂及处理 一、杂交前准备 （一）DEPC 水是经 DEPC 处理过的灭菌蒸馏水。 DEPC 即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate ），可灭活各种蛋白质，是 RNA 酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经 DEPC 处理。方法是：取市售 DEPc 1ml ，加入 1L 待处理水（蒸馏水等）中，经 猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解 DEPC （DEPC 分 解为 CO2 和乙醇）。有些试剂可直接加入 DEPC ，终浓度一般为 0.1%～0.4%， 原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用 DEPC 处理，或用 DEPC 水配制，包括乙醇的稀释。此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需 DEPC 水洗涤。 注意：①DEPC 是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进 行，并避免接触皮肤。②含有 Tris 缓冲液的溶液中，不能加入 DEPC 。 （二）载玻片的处理 组织原位杂交，常在载玻片上进行，故载玻片的洗涤至关重要，必须保持清 洁，并且不能有任何核酸的污染。处理方法如下： （1）先经洗衣粉浸泡过夜，次日自来水冲洗后，泡酸数小时以上，取出后 再用流水冲洗，双蒸水冲洗 2～3 次，置 160℃以上烤箱中烧烤4h 以上，或经 15 磅高压灭菌 20min 。经以上处理可清除载片上的核酸酶。 （2 ）HCl 处理法 （三）硅化 【方法１】（1）将一扎新的盖玻片散开，在通风条件下于 0.1mol/L 的 HCI 中煮20min,等其冷却后,倒掉盐酸。 （2 ）用去离子水沉漂洗玻片，竖放在架子上自然干燥。 （ 3 ）硅化盖玻片：通风条件下，将单块的盖玻片在二甲二氯硅浣 （dimethyldichorsilane,DMDC ）液中浸几下，竖入在架子上干燥。 （4 ）收集干燥的盖玻片于一可耐热的petri 氏盘（或培养皿）中，用去离子 水漂洗数次，彻底清洗。 （5 ）用铝箔将装有盖玻片的培养皿包好，于 180℃烘烤4h 过夜。取出待冷 中国试剂网 3.18.2 至室温后，即可进行后续处理。 附：2%DMDC 配制：按比例两者充分混匀，静止待气泡消失即可使用。 用途：硅化玻片（载片、盖片均可）。 【方法 2 】将经过洗净的玻璃盖片分散开放在一金属网中，并将该网放入一 接有真空泵的干燥器中。同时，在干燥器中放一盛有约 1m 二甲二氯硅浣 （dimethyldiorosilane,DMDC ）的小烧杯。盖好干燥器（确必威体育官网网址闭），抽真空约 5min， 然后让空气冲入。取出盛有盖片的金属网架，用锡箔纸包埋，于 250 ℃以上烘烤 4h 以上，最好过夜。冷却后备用。 本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于 60℃烧干。 【方法 3 】APES （氨丙基三乙氧基硅浣）法 【方法 4 】 （1）49ml 氯仿与 1mg 二甲二氯硅浣（DMDC ）配液； （2 ）倒入每个拟硅化的试管或离心管中，浸泡 5min 后用乙醇或重蒸水冲洗； （3 ）玻璃器皿使用前位于 180℃以上烘烤2h 以上，塑料器皿应于60℃烘烤 过夜。 注意：DMDC 有毒且高度挥发，应于通风环境操作并戴口罩、手套，避免 接触皮肤或吸入。 （四）载片的包被（粘贴） １．沾附剂 （1）多聚赖氨酸(poly-L-Lycine,PLL) 储备液（0～5% ） 按上述剂量充分混合，即为浓度为 5mg/ml(0.5%)的 PLL 液。常分装成 1ml 的包装，-20℃存放。该液为储备液，可反复冻融，无明显影响。用前充分混合。 工作液（0.01% ）： 充分混合，静止待气泡消失。 （2 ）明胶液 配法：先称取明胶