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生物检测技术 ——PCR技术 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)，体外核酸扩增技术。 能在一个试管内将所要研究微量的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。 PCR使人们能通过试管内的数小时的反应将特定的DNA片段扩增数百万倍。该技术已成为分子生物学研究的重要技术体系，其建立极大地推动了生命科学的研究进展。在DNA重组与表达、基因结构分析与功能检测具有重要的应用价值。 PCR技术的创建 Kary B. Mullis（穆利斯（美）） Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,扩增DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 PCR技术的原理 PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，反应原理与细胞内的DNA复制相似，但PCR的反应体系要简单的多，主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3’末端互补的合成引物、四种dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。基本过程是以拟扩增的DNA分子为模板，首先高温变性，将混合物加热到94℃维持l5到3O秒，使模板DNA双链解旋成两条单链；然后逐渐降温退火，温度降到55℃ ，使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；最后在引物、DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。如此循环20次原始DNA将扩增约l0的六次方倍。经过扩增后的DNA产物多为介于引物与原始DNA想结合的位点之间的片段。 PCR原理图 三磷酸脱氧核苷酸：四种三磷酸脱氧核苷酸(dATP，dTTP，dGTP，dCTP)是PCR反应的原料。四种各dNTP分子浓度必须相等，以减少错配。 耐热DNA聚合酶：耐热DNA聚合酶的发现，实现了PCR的自动化，能经受95℃ 以上的高温而不失活。 其他成分：二价Mg离子能活化DNA聚合酶；DMSO有利于DNA的变性；TMAC可去除非特异扩增，促进PCR；甘油有利于DNA复性，不过并不是对所有的PCR都有利。 PCR反应条件优化选择 首先是PCR反应循环阶段的优化选择：变性的温度和时间的控制，一般在第一轮循环前先进行94℃预变性3～l0min，以便使模板D N A完全解链，然后加入TaqDNA聚合酶趁热启动，这样可减少聚合酶在低温下仍有活性而引起的非特异性扩增；退火温度的控制，一般来说，退火温度越高，所得产物的特异性越高，但也不能太高，否则会影响引物与模板的碱基配对；延伸的温度和时间控制，一般延伸的温度设定在所用DNA聚合酶的最适温度附近，若不合适的温度，不仅影响产物的特异性，也会影响产量；延伸时间不宜过长，否则会导致非特异性产物扩增带的出现。 然后是PCR反应成分的优化选择：模板核酸首先必须纯化，除去蛋白酶等杂质，浓度因反应不同而有所选择；引物首先要质量高，需纯化，引物设计要合理；反应缓冲系统中常加入KCl而有利于退火，对于不同PCR反应，缓冲条件亦有所不同；三磷酸脱氧核苷酸的浓度应适宜，过高可加快反应速度，但同时也增加了碱基错配率，反之可提高反应的特异性；耐热聚合酶的浓度也应适宜，过少会影响靶序列扩增产量，过的会导致非特异性的扩增。 最后是采用热启动的方法使耐热DNA聚合酶仅在反应体系到较高的温度是才发挥作用，消除非特异性的扩增，提高PCR反应的特异性和敏感性。 PCR产物的检测 PCR反应进行完了之后，必须对其产物进行检测才能判定此反应产物是否为特异性扩增，结果是否准确可靠。目前发展了很多PCR产物检测方法，常用的方法有：1)凝胶电泳分析法，将产物进行电泳，常用溴乙锭染色，根据在紫外光下发出的荧光确定片段在凝胶中的位置，并以此来判断扩增片段的大小。2)Southern印迹杂交法，在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。3)核酸序列分析法，对PCR产物直接进行测序，是PCR产物分析最精确的方法，但也是最为繁琐的方法。 PCR仪器梯度PCR仪 PCR荧光分析系统 PCR技术的应用 一 这里仅以结核杆菌为例，说明PCR技术在病原生物检测中的应用。 结核杆菌①标本的采