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细菌耐药机制及检测; 一、细菌耐药的遗传机制 细菌耐药性的遗传学机制主要指细菌的耐药性通过基因突变(即染色体介导的耐药性)获得，或通过质粒或转座子水平传播获得外源耐药性基因，也可通过整合子捕获外源基因使之转变为功能性基因来传播耐药性。;三、当前主要的耐药性问题 革兰阳性菌：耐青霉素肺炎链球菌（Penicillin resistant Streptococcus pneumoniae,PRSP）；耐甲氧西林葡萄球菌（Methicillin resistant Staphylococci,MRS）；耐万古霉素肠球菌（Vancomycin resistant enterococcus,VRE）及耐万古霉素金黄色葡萄球菌（Vancomycin resistant S.aureus,VRSA）。 革兰阴性菌：产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌(ESBLs)；持续高产Ι型β-内酰胺酶的阴沟肠杆菌、枸橼酸杆菌等；多重耐药的铜绿假单胞菌、不动杆菌、嗜麦芽窄假单胞菌。 对异烟肼和利福平耐药的多重耐药结核分枝杆菌（Multidrug resistance Mycobacteria tuberculosis,MDR-Tb）。;四、主要的耐药性检测方法 （一）耐青霉素G的肺炎链球菌（PRSP） 筛选试验：1μg/片苯唑青霉素，MH琼脂+5%羊血，35℃含5%CO2%环境中孵育20-24小时，抑菌环直径≤19mm耐药，≥20mm敏感；确证试验：稀释法测定青霉素MIC，MIC≤0.06μg/ml敏感 ≥2μg/ml耐药。 ;（二）耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS） （1）纸片筛选法：含4%NaCl的MH琼脂，30μg/片头孢西丁，33-35℃，24小时。对于金黄色葡萄球菌，抑菌环直径≤19mm，为MRSA，抑菌环直径≥20mm，为MSSA；对于凝固酶阴性葡萄球菌，抑菌环直径≤24mm，为MRCONS，抑菌环直径≥25mm，为MSCONS。 （2）琼脂筛选法：MH琼脂中加入6ug/ml苯唑西林、4%氯化钠，直接菌落悬液法，涂布接种，≤35℃，孵育至24小时。任何有生长的现象均为MRS。 （3）乳胶凝集或基因扩增法直接检测MecA基因。;（三）万古霉素中介或耐药的葡萄球菌，VIS或VRS 筛选方法：MH琼脂，万古霉素（30μg/片），抑菌环直径≤14mm应测MIC；肉汤稀释法MIC8～16μg/ml为VIS，MIC≥32μg/ml为VRS。任何耐万古霉素的葡萄球菌均应送参考实验室进一步检测。 ;（四）耐万古霉素的肠球菌 检测方法：30μg/片万古霉素，抑菌环≤14mm为耐万古霉素肠球菌。;（五）超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamases ESBLs） （1）药敏推测法：根据ESBLs能水解三代头孢的原理进行检测。用标准琼脂扩散法测定头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、头孢泊肟和头孢曲松的抑菌环直径，按NCCLS标准进行判断。凡头孢他啶抑菌环直径≤22mm、头孢泊肟抑菌环直径≤17mm、氨曲南或头孢噻肟抑菌环直径≤27mm、头孢曲松抑菌环直径≤25mm，任何一种药物抑菌环直径达到上述标准，或用稀释法检测上述药物的MIC大于等于2ug/ml,均疑为ESBLs菌株。应进一步作确证试验确诊。 （2）表型确证试验：根据ESBLs可被克拉维酸抑制的原理，按NCCLS推荐的指南进行操作，包括纸片法和稀释法。前者采用头孢他啶(30μg)及头孢他啶/克拉维酸(30μg/10μg)组合，头孢噻肟(30μg)及头孢噻肟/克拉维酸(30μg/10μg)组合，任一组药物的抑菌环的直径差≥5 mm时，判定为ESBLs阳性株。 ;（3）双纸片协同法：根据ESBLs可水解三代头孢，有可被克拉维酸抑制的原理，将阿莫西林/克拉维酸抑制纸片置于头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松和氨曲南中间，使两纸片中心间距为20～30mm，如果在阿莫西林/克拉维酸与任何一种纸片间出现协同抑菌现象,视为产ESBLs株。此法操作简便，特异性、灵敏度菌较好，可作为检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌产ESBLs的常规方法。 （4）头孢曲松三维试验：根据ESBLs可水解三代头孢，但不被氯唑西林抑制的特点，按标准纸片扩散法操作，取相当于0.5麦氏浊度的标准大肠埃希菌ATCC25922菌液，接种M-H琼脂平板，平板中心贴一30ug头孢曲松纸片，再距头孢曲松纸片5mm处分两个方向划两条长约15mm的狭缝，其中一条加40ul酶提取液，另一条加36ul酶提取液和4ul2*10000umol氯唑西林，35℃过夜，若单加酶提取液的狭缝和加酶提取液和氟氯西林的狭缝与抑菌圈交接处均出现扩大生长区域，视为ESBLs三维试验阳性。此法利用酶的粗提物检测，又用氯唑西林抑制