课用蛋白质组学的研究方法和进展.pptVIP

20世纪生命科学的辉煌成就 1953年Watson Crick，DNA双螺旋结构提出 1957年，“中心法则”的问世 20世纪90年代，人类基因组计划（HGP） 基因组计划的局限 无法解决“基因精细调控”问题 “mRNA” 无法反映蛋白质的质与量。 　　　以往人类对于蛋白质的研究只是针对生命活动中某一种或某几种蛋白质，难以形成一种整体观，难以系统透彻地阐释生命活动的基本机制。 第一节 蛋白质组学的概念及其发展史 蛋白质组（proteome） 蛋白质组学(proteomics) 从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 主要研究内容 功能蛋白质组学(functional proteomics) 细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的全部蛋白质。 The HUPO World… 一、蛋白质组表达模式研究方法 研究蛋白质组的组成成分 主要技术有双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学技术。 （一）蛋白质组研究中的样品制备 采用细胞或组织的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。 进行样品预分级，将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究，提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。 样品预分级的主要依据 蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等 蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等 蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等 组织水平蛋白质组样品制备 原因：临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。 激光捕获显微切割(laser capture microdissection，LCM) 可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。 （二）蛋白质组研究中的样品分离 双向凝胶电泳 (two-dimensional electrophoresis, 2-DE) 利用蛋白质等电点和分子量差异，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。 工作原理： 根据蛋白质等电点的不同进行第一向等电聚焦电泳分离 转移到第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，再根据相对分子质量大小不同进行分离 固相pH梯度等电聚焦的优点 克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。 可以精确设定pH梯度。 尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。 固相pH梯度等电聚焦电泳（第一向）示意图 二维电泳的主要步骤： 1. 样品准备 　2. 第一维：固相pH梯度等电聚焦 　3. 第二维：SDS电泳 　4. 染 色：考马氏亮兰或银染 　5. 图像分析：肉眼或自动扫描 二维电泳优点 可分离10～100 kD 范围内蛋白质 高灵敏度和高分辨率 便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配 二维电泳缺点 极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。 胶内酶解过程费时、费力，难于与质 谱联用实现自动化。 新型非凝胶技术 液相色谱法 分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 排阻色谱法 毛细管电泳 “软电离”的特点 分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。 灵敏度高、快速、能同时提供样品的精确分子量和结构信息、既可定性又可定量、并能有效地与各种色谱联用来分析复杂体系。 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS） 电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS） Sample MS Spectrum 典型二级质谱图 肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功的可能原因 样品量太少，PMF图信噪比太低 2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质 角蛋白或其他蛋白质的污染 蛋白质发生较多的转译后修饰，数据库中未有记载 所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多 未知的新蛋白质 数据库规模太小 液质联用技术（LC-MS/MS） 根据蛋白质带电性及疏水性不同，用MS分离多肽复合物。 （四）蛋白质组学研究的生物信息学 生物信息学是蛋白质组学研究的一个不可缺少的部分。 SWISS-PROT: http://www.expasy.ch/sprot/ 拥有目前世界上最