标 记 免 疫 技 术PPT.ppt

（一）斑点ELISA (dot-ELISA) （二）免疫印迹法（immunoblottingtest，IBT） 亦被称为Western blot 分三个阶段进行 : SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 电转移 酶免疫定位 免疫印迹法原理示意图 第二节 荧光免疫技术 免疫荧光技术(immunofluorescence technique)是标记免疫技术中发展最早的一种。是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合起来的一种方法。 基本原理 利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中的待检抗原特异结合，采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光，借助荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有无待检抗原或抗体。 一、免疫荧光显微技术 （一）基本原理：使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。 （二）荧光抗体的制备 （1）荧光抗体的标记 作为标记的荧光素应符合以下要求： ①应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。 ②荧光效率高,与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。 ③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 ④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质，与蛋白质的结合物稳定，易于保存。 ⑤标记方法简单、安全无毒。 荧光抗体是将荧光素（如FITC）与特异性抗体以化学方式共价结合而成。 常用于标记的荧光素：异硫氰酸荧光黄（FITC） 四乙基罗丹明（RB200） 四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC） 标记方法：搅拌法(适合大样品) 透析法(适合小样品) 标记抗体的纯化：透析法、层析分离法 （2）荧光抗体的鉴定 F/P比率： 将制备的荧光抗体稀释至A280≈1.0，分别测读A280（蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰。 F/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。一般用于固定标本的荧光抗体以F/P＝1.5为宜，用于活细胞染色的以F/P＝2.4为宜。 抗体效价：效价越大标记抗体的特异性越高非特异荧光越少。效价在1:16-1:32者较为理想。 抗体特异性 ：免疫电泳和交叉免疫电泳观察特异性沉淀线或沉淀峰，在紫外线照射下发出强烈荧光。 （三）技术类型 直接法 优点：操作简便、特异性高、非特异 荧光染色因素少。 缺点：灵敏度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。 间接法 优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。 （四）荧光免疫显微技术在 医学检验中的应用 1．血清中自身抗体的检测 2．各种微生物阶快速检查和鉴定 3．寄生虫感染的诊断 4．白细胞分化抗原的检测 5．人类白细胞抗原(HLA)的检测 6．肿瘤组织中肿瘤抗原的检测 7．组织中免疫球蛋白和补体组分的检测 8．激素和酶的组织定位 二、荧光免疫测定技术 荧光免疫测定同酶免疫测定一样，根据抗原抗体结合后是否需要将结合状态与游离状态的的荧光标记抗原（或抗体）分离开，而将之为均相和非均相两种类型。 (一)时间分辨荧光免疫测定 1.基本原理 时间分辨荧光免疫测定(time-resolved fluorescence immunoassay，TR-FIA)是荧光分析（FIA）的基础上，用具较长寿命荧光的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的作为标记物来标记抗体或抗原，从而检测标本中的相应抗原或抗体的新技术。 2.技术类型 (1)固相双位点夹心法 (2)固相抗原竞争法 (3)固相抗体竞争法 (二)荧光偏振免疫测定 FPIA是一种均相竞争荧光免疫分析法。 其原理是：标本中的抗原与荧光标记的抗原竞争结合抗体。反应平衡后，与抗体结合的荧光标记抗原的量与标本中抗原浓度的量呈反比。由于抗体的分子量远大于抗原的分子量，游离的荧光标记抗原与结合抗体的荧光标记抗原所产生的偏振荧光强度相差甚远。因此在FPIA中测定的偏振荧光强度与标本中抗原的浓度呈反比。通过小分子抗原标准品与荧光偏振强度关系建立标准曲线，可检测小分子抗原的浓度。 第三节 放射免疫技术 放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA） 免疫放射分析（immunoradiometric assay,IRMA）