2014-免疫学检验与临床应用PPT.pptx

免疫学检测原理及临床应用; 免疫学检验是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术，在疾病的诊断、疗效评价中应用广泛。;细胞水平检测;一、免疫细胞的检测;密度梯度离心(Ficoll)离心　;E花环沉降法 ：分离T细胞（CD2-绵羊红细胞） 尼龙毛柱分离法 ：分离T或B细胞（B细胞尼龙毛的粘附力）。 贴壁法：分离Mφ;利用细胞表面标志;流式细胞术（Flow cytometry，FCM）;流式细胞仪工作原理;;流式细胞术技术分析;免疫磁珠分离immunomagnetic?beads;免疫磁珠分离的正选法和负选法;抗原肽-MHC四聚体分离技术;淋巴细胞的功能检测;T淋巴细胞增殖试验;淋巴细胞转化的刺激物;形态学检查法;3H-TdR掺入法;T细胞杀伤功能测定;MTT实验 MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。 原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比;MTT增殖实验结果;体内试验;二、B细胞功能检测;(一)B细胞增殖能力的试验;(二) 溶血空斑试验;3．临床应用与评价;酶联免疫斑点Enzyme Linked ImmunoSPOT;1.ELISPOT技术起源与发展; 用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子（或B细胞分泌的抗体），并以斑点显色的方式将其表现出来。;1.包被抗体 4℃ 过夜，洗涤； 2.封闭37 ℃ 1h； 3.加入淋巴细胞和刺激原37 ℃孵育8-40h； 4.冰水裂解并移出细胞，洗涤； 5.加入生物素标记的检测抗体37 ℃ 1h，洗涤； 6.加入酶联亲和素37 ℃ 1h，洗涤； 7.加入显色底物，显色10~40min； 8.获得斑点，计数。;Elispot实验结果（透明板）;细胞吞噬功能测定;巨噬细胞吞噬试验;1.反映机体免疫功能状态。 2.肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。 3.组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。 4.单克隆抗体和细胞因子的生产。;免疫标记技术 ;免疫酶测定法;免疫组化技术;放射免疫测定法(RIA)示意图;形态学检测 普通光学显微镜检测 荧光显微镜检测 材料：①石蜡切片; ②冰冻切片; ③细胞涂片 ; 形态学方法： ① PI染液：碘化丙啶(propidium iodide,PI)；核红色 ② DAPI染液；核蓝色 ③ AO染液（吖啶橙）：核黄绿色 * 凋亡细胞呈现核浓缩, 染色加深,凋亡小体。 ;凋亡的形态学检测; 在细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在DNA片段化之前，因而检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。PI的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(P1)来区分凋亡和坏死细胞。;荧光显微镜观察细胞凋亡;流式检测细胞凋亡; 生化学方法电泳法 DNA Ladder电泳图谱;凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活, 核DNA被切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA单链断裂点(缺口), 暴露出大量3-羟基末端, 如用(TdT)将标记的-dUTP进行缺口末端标记, 则可原位特异地显示出凋亡细胞。 (一)荧光标记法 (二)酶标记法 ;TUNEL染色原理;临床意义--IgG 增高 ;见于各种先天性和获得性免疫缺陷病、联合免疫缺陷病、也见于重链病、轻链病、肾病综合症、病毒感染和免疫抑制剂患者; IgA增高 见于IgA型MM（多发性骨髓瘤），SLE,类风湿性关节炎，肝硬化，湿疹和肾脏疾病等 IgA降低 见于反复呼吸道感染，原发和继发性免疫缺陷病和自身免疫性疾病;(1)增高：常见于一些急性时相反应，如急性炎症、传染病早期、排异反应、急性组织损伤。?(2)减低：见于系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎活动期、大多数肾小球肾炎(如链球菌感染后肾小球炎、狼疮性肾炎、基底膜增殖性肾小球肾炎)、慢性活动性肝炎、慢性肝病、