医学细胞生物学（李朝军）第三章 细胞方法.pptxVIP

临床科研课题的设计与研究方法KnowledgeExperience Creativity为什么做科研？不是目的，是训练！科学的思考问题的方式科学的解决问题的方式科学的探索问题的方式科学的精神课题设计流程：原始观察 提出假设 设计对照实验Refer to knowledge 收集数据 解释结果 结论临床观察现象肥胖骨质疏松三件事：证实相关性确定因果关系探讨内在机制证实相关性文献：类似报道设计实验：制定相关性指标：肥胖：BMI，血脂 etc骨质疏松：骨量测定确定因果关系：三板斧该因素是否现象有关加强该因素的作用，现象是否放大抑制该因素的作用，现象是否消失或减弱生理因素、基因功能确定因果关系病人？动物模型！药物诱导基因组改造targetneorTKtargetingvectorhomologous recombinationneor“knockout”Knockout by HR in ESCs Totipotent embryo stem cell Homologous recombinationZhu H, et al. Nature Rev. Genet. 2011, 12: 266-275.Targeted genome editing with RNA-guided Cas9Hwang W, et al. Nat Biotechnol. 2013, 31: 227-229.Cho S, et al. Nat Biotechnol. 2013, 31: 230-232. Jiang W, et al. Nat Biotechnol. 2013, 31: 233-239. 表型分析：动物模型：引起肥胖 引起骨质疏松观察制定相关性指标：肥胖：BMI，血脂 etc骨质疏松：骨量测定需要收集的证据：生化检测生理数据分析组织学检测细胞学检测信号通路检查基因表达分析鉴定相关基因生化检测生理数据分析组织学检测细胞学检测发育生物学分析信号通路检查基因表达分析动物模型靶基因？药物筛选基因治疗真核生物具有十分相似的细胞周期调控机制单细胞的酵母：细胞分析蛙的早期胚胎：生化分析果蝇：遗传分析哺乳动物的培养细胞：细胞功能分析1， 酵母芽殖酵母Saccharomyces Cerevisiae裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe 芽殖酵母Saccharomyces Cerevisiae裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe酵母中细胞周期调控的遗传分析 特点：快速增殖较小并完全明确的基因组能在单倍体状态下进行繁殖，染色体以单个拷贝或同源物在细胞中存在容易制造突变来失活某个基因容易删除特定基因容易用已知突变来取代特定基因2， 黑腹果蝇 Drosophila melanogaster世代周期为2周，在实验室控制条件下容易生长。细胞周期调控系统的成分与特征——尤其是多细胞动物特有的——与人的极为相似。果蝇的基因组含有约14,000个基因，大概是酵母的两倍，人细胞的一半。外源基因也能够在特定的组织中或在诱导型启动子的控制下异位表达。对经典遗传学来说，用果蝇能很容易地进行突变基因的筛选。第一节 细胞的形态观察形态观察是细胞生物学最基本的研究方法，其工具主要为显微镜 根据光源的不同，可将显微镜分为： 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 电子显微镜 ：以电子束为光源。一、显微镜的光学原理: Human eye显微观察方式相差观察方式应用：无色透明活体标本的细微结构，检查,鉴定活体细胞(培养细胞,分离细胞)微分干涉（DIC）观察方法几种显微镜的效果比较：荧光显微镜： 细胞中的某些物质如叶绿素受到紫外光的照射可以发出荧光，尤其是细胞内的物质可以特意地结合荧光染料后，受到特定波长的光的激发可以发出荧光，这样我们可以对这些物质进行定性和在细胞内的定位研究 。用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。（五）激光共聚焦显微镜： 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍一、Confocal的原理xy为什么选择 Confocal?Confocal 最大限度减少了背景模糊像的干扰PMT焦平面上的点成像光路 xy为什么选择 Confocal?Confocal 最大限度减少了背景模糊像的干扰PMT焦平面以下的点的成像光路xy为什么选择 Confocal?Confocal 最大限度减少了背景模糊像的干扰PMT焦平面以上的点的成像光路可以对样品进行光切片，进行活细胞的观察内部的结构，在计算机辅助下，对样品进行分析。 （六）高分辨率显微镜自从1873年Ernst Abbe第一次发现光学成像具有衍射限制现象以来，物理学界就公认，显微镜的分辨率具有极限，该极限与光源的波长有