荧光定量PCR常见问题与解答.docxVIP

1 、什么是定量PCR ？以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。2 、定量PCR 定量的理论依据是什么？特定的待扩增基因片段起始含量越大，则指数扩增过程越短，当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，最终扩增片段的含量通常是一样的。 理想的扩增结果：Y=X×2 n 其中Y代表扩增产物量， X代表PCR反应体中的原始模板数 n为扩增次数； 理论上PCR扩增效率为 100%，PCR产物随着循环的进行成指数增长，但实际上：DNA的每一次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈 2 的倍增长；实际应为：Y= X(1+E) n ，其中E 代表扩增效率：E = 参与复制的模板/总模板，通常E≤1，E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。通常X 在 1～105 拷贝、循环次数n≤30 时，E 相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；随着循环次数n的增加（30次），E值逐渐减少，Y 呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期。3、 荧光定量PCR定量的理论模式又是什么？PCR 是对原始待测模板核酸的一个扩增过程，任何干扰 PCR 指数扩增的因素都会影响扩增产物的量，使得 PCR 扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。近年来研究人员通过大量的实践，研究了相对准确的定量 PCR 方法，即荧光定量 PCR。PCR扩增通式：① T n =T 0 （1+E） n② Tn =Tn- 1 （1+E）n 注：[0E 1] 其中E表示扩增效率，n为循环数，T n 表示在n个周期后PCR产物的数量，Tn- 1 表示在n-1 个周期后PCR产物的数量，T 0 为原始模板数量。设定PCR到达指数扩增期时，产生一定的荧光(荧光依赖于某一循环扩增产物的总量，即特定的拷贝数K，为常数，大约在 10 10 左右)高于背景为仪器所识别，此时的循环数为CP（crossing point）,也就是K= T 0 （1+E） CP ，取对数即：lg K=lg T 0 +CP*lg(1+E)CP=- 1/lg(1+E)*lg T 0 +lgk/lg(1+E)由于对一特定的PCR而言，E与K均为常数，故上式为循环数（CP）对原始模板拷贝数的对数（lg T 0 ）一次方程，其标准形式y=kx+b,该直线的斜率为- 1/lg(1+E)，在横坐标上的截距为lgk/lg(1+E)，也是荧光定量PCR所谓的标准曲线。例如下图为单管实时荧光定量RT-PCR的标准曲线：目前荧光定量 PCR 均采用外标定量外标法定量PCR扩增效率的计算，由于标准曲线的斜率(Slope)为- 1/lg(1+E)，可知E=10 -1/Slope -1 ,如从标准曲线中知道Slope=-3.337,则可推知扩增效率E=10 1/3。 337 -1=0.99,也有作者将(1+E)直接视为扩增效率E，则E=10 -1/Slope ，求得的E值均在 1—2 之间，有时也有大于 2的结果，如下图所示。另外也可直接根据系列稀释外标在该次实时荧光PCR的结果来大略分析扩增效率的高低，例如系列 10 倍稀释外标在PCR扩增时有N 2 =N 0 E n2 , N 3 =(10*N 0 )E n3 ,在扩增到指数期时荧光值相同则代表此点的终末拷贝数相同，即N 2 =N 3 ，E n2-n3 =10,取对数得到⊿n gE=1, E=10 l1/ ⊿ n ，E=2，⊿n=3.32; E=1.8，⊿n=3.91.反之亦然。如图所示。4、定量 PCR可以分成哪几类？根据反应体系是否设有参照物以及是否与标本在同一管中进行扩增，定量 PCR 可分为四种方法：定量 PCR根据反应体系是否设有参照物以及是否与标本在同一管中进行扩增，定量 PCR 可分为四种方法：①有限稀释法，即倍比稀释法：通过稀释阳性样品直至靶基因不能再扩增为止，来设置已知浓度的参照品；根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线，计算出待检标本中原始模板的分子数；利用最大稀释度来进行标本核酸定量时的注意点 A、PCR 产物的最低可检测极限须有重复性；B、对每个稀释度必须作多次 PCR ，一般先对模板 DNA 作 10倍连续稀释后作 PCR，首先找到 PCR 结果呈阴性的接近稀释点 ，然后再对各稀释度作系列的 2 倍稀释，每个稀释点作 5 次 PCR；C、必须严格控制污染 。优点：不需要特殊设备；缺点：扩增反应条件的标准化、严格注意污染，避免假阳性的产生。②使用外参照物的定量 PCR，以已知浓度的目的基因为模板，按一定的倍比稀释，然后做出