第二代测序技术研究现状.docxVIP

第二代测序技术的发展生物的遗传信息都储存在其DNA中，解读其DNA的核苷酸序列，对于揭示探索生命奥秘、治疗疾病，以及对整个生物科学乃至医学的发展起到了巨大的推动作用，并具有广阔的应用前景。基因组重测序是相对于全基因组de novo 测序而言的，是借助于第二代测序技术和计算机分析技术，迅速发展起来的，并被生物学家广泛应用的一种测序方法。第二代测序技术，又称新一代测序技术（next generation sequencing），相对于基于Sanger 法的测序原理，结合荧光标记和毛细管阵列电泳技术来实现测序的自动化的第一代测序技术而得名的。第二代测序技术依据不同的测序原理，主要包括三个平台：Illumina公司的Solexa Genome Analyzer 测序平台、ABI公司的Solid 平台、罗氏454公司的GSFLX测序平台， 虽然它们的测序原理不完全相同，但共同的特点是都不需要传统的克隆步骤，实现了更高的通量。与第一代测序技术相比，第二代测序技术不仅保持了高的准确度，而且大大 减低了测序成本并极大地提高了测序速度。罗氏454公司的GSFLX测序平台454测序系统是第二代测序技术中第一个商业化运营的测序平台，它的原理如下：待测DNA文库的构建 把带测序列用喷雾法（nebulization）打断成300—800bp的小片段并在两段加上不同的接头，或者将待测序列变性后用杂交引物进行PCR扩增，链接载体，构建单链DNA（ssDNA）文库。Emulsion PCR 将这些ssDNA与水油膜包被的直径大约28um的磁珠连在一起孵育、退火，由于磁珠表明含有与接头互补的寡聚核苷酸序列，因此ssDNA会特异地连接到磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，因此可以保证每一个与磁珠结合的小片段都会在各自的孵育体系内独立扩增，扩增产物扔可以结合到磁珠上。反应完成后，破坏孵育体系并富集带有DNA的磁珠。经过扩增反应，每一个小片段都将被扩增大约100万倍，从而达到下一步测序反应所需要的模板量。测序 预先用Bacillus stearothermophilus 聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠，然后将磁珠放置在一种叫做PicoTiterPlate(PTP)d平板上。PTP板上含有很多直径约44um的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法固定每个磁珠的位置以监测接下来的测序反应。测序反应采用焦磷酸测序法，将一种含有PTP半山小孔直径更小的磁珠放入小孔，启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增的ssDNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行核查反应。如果这种dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化酶反应形成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化体系中的荧光素分子并发出荧光。测序反应产生的荧光信号由放置在PTP板另一侧的CCD照相机记录，再经过计算机分析转换为测序结果。由于每种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同，因此可以根据荧光的颜色来确定被测分子的序列。反应结束后，游离的dNTP会在双磷酸酶的作用下降解ATP，导致荧光淬灭，从而使反应体系再生。作为一个反应器，由于PTP板上每个小孔之间相互独立，因而大大降低了反应的干扰和误差。 454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物（homopolymer）的长度。例如当待测序列中出现PolyA的情况下，测序反应中会加上多个T，而加入T的数目只能从荧光信号的强度来推测，有可能 早晨结果不准确。也正是因为这个原因，454技术主要的错误不是来自核苷酸的替换，而是来自插入或缺失。454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。2）Illumina公司的Solexa Genome Analyzer 测序平台Illumina/Solexa Genome Analyzer测序于2006年问世，是一种基于Solexa技术的测序系统，其基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。其操作流程如下：①测序文库的构建（Library Construction） 首先准备基因组DNA（虽然测序公司要求样品量要达到200ng，但是Gnome Analyzer系统所需的样品量可低至100ng，能应用在很多样品有限的实验中），然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头（Adaptor）。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然后再片