遗传基因保鲜 保鲜技术课件.pptVIP

遗传基因保鲜 利用遗传基因进行保鲜是生物技术在食品贮藏保鲜上应用的又一典型例子。其原理是通过遗传基因的操作从内部控制某些食品的成熟过程；利用DNA的重组和操作技术，来修饰遗传信息；或用反义DNA技术来抑制成熟基因的表达，进行基因改良，从而达到推迟某些食品特别是果蔬的成熟衰败，从而达到延长贮藏期的目的。 1979年，Adams和Yang(1979)阐明了乙烯合成的主要途径，其主要步骤为 ： 乙烯合成途径中关键酶的研究 （1）ACC合成酶（ACS） 为乙烯生物合成的关键酶或限速酶。该酶于1986年首次从番茄果实中纯化（Bleecker et al），其基因于1989年首先从小西葫芦果实中获得（Sato et a1.）。 此酶存在于组织的细胞质中，很容易失活，半寿期短，以单体或二聚体，甚至三聚体形式存在，以单体存在时活性较强，在催化反应时较不易失活。 ACS由多基因家族编码，不同因子可诱导该家族中不同成员表达，不同来源或同一来源的基因家族不同成员在序列上均存在8个保守区。 ACS专一性的以AdoMet为底物，以磷酸吡哆醛(PLP)作为辅基，AVG和AOA是ACS的竞争性抑制剂。 （AVG — 氨基乙氧基乙烯基甘氨酸；AOA — 氨基氧乙酸） ACS可以被外源乙烯诱导产生。 Oeller et a1．(1991)利用番茄中克隆到的ACC合成酶基因(L-ACC2)，反向插入到CaMV35S启动子和NOS终止子之间，再与 pBI101相连，转化番茄子叶并获得转基因植株。由于转基因植株中反义RNA的作用，果实成熟中乙烯所诱导的ACC合成酶基因的表达受抑制，阻止了其mRNA的积累，因而ACC合成酶的数量减少。在转基因植株果实中乙烯的合成量较非转基因果实降低了99%，几乎完全抑制了乙烯的合成，并且成熟时间推迟30-90天。 转基因果实也可以用乙烯、丙烯或乙烯类似物进行催熟，催熟的果实与自然成熟的果实在质地、颜色、芳香气味和压缩性等方面无明显区别。 Savin et a1.(1995)把反义ACC基因转入康乃馨中，转化植株没有明显的乙烯呼吸峰，并且可以延迟花瓣衰老，在采收后很少或几乎没有ACS mRNA的存在。 Kiss et a1．(2000)利用反义RNA技术把反向的ACC合成酶基因通过EHA105和LBA4404．转入到康乃馨中，然后用Kan抗性筛选，此后对初筛的小苗首先通过NPTII的特异引物进行PCR检测，然后做NPTII的Southern杂交以及RT-PCR检测，证实外源基因已转入康乃馨中，待转化植株开花时测定乙烯的释放情况、花瓣衰老快慢、插花寿命长短等，发现乙烯明显减少，并推迟花瓣衰老，延长瓶插寿命。 （2）ACC氧化酶(ACO) ACC氧化酶是乙烯合成途径中的最后一个酶。此酶最早被Yang及其同事定名为乙烯形成酶(EFE)。它需要抗坏血酸和氧作为辅助底物，Fe2+和C02作为辅助因子。 ACC氧化酶是单体，分子量在40KD左右。现已证实该酶也存在同工酶，与ACS一样，ACO也为多基因家族所编码。 不同植物ACO基因的同源性比ACS高， 一般在蛋白质水平上同源性都在80％以上。目前已从康乃馨、矮牵牛、天竺葵、番茄、甜瓜、绿豆、豌豆、花椰菜、芥菜、桃、猕猴桃、苹果和鳄梨中分离到该酶基因。在番茄中克隆到三个ACO基因，矮牵牛中克隆到4个ACO基因，在康乃馨中也克隆了多个ACO基因(Barry et a1.,1996；Tang et a1.，1993；Wang et a1.，1991)． 该酶是组成性的，不构成乙烯生物合成的限速酶。但在果实成熟和组织培养过程中，它往往也是限速酶。 在转化反义ACC氧化酶的康乃馨中，反义基因表达可以延长花在瓶中的寿命，所用植物材料RedSim和WhiteSim的花儿乎不产生乙烯，从而延缓花瓣衰老。采收后，反义ACO花生成很少或没有ACOmRNA(SaVin et a1.，1995)。因此，通过反义基因抑制乙烯合成可以延缓观赏植物花的衰老。 （3） ACC脱氨酶(ACDS)基因 自1978年Honma Shimomura发现ACC脱氨酶以来，已先后在多种土壤微生物(如细菌、真菌和酵母)中发现该酶的存在(Sheehy et a1.，199l；Jacobson et a1.，1994；卫军等，1994；Campbell et a1.，1996；Shah et a1.，1998)，但目前尚未在植物中发现ACC脱氨酶。该酶最早是从土壤细菌Pseudomonas sp．中分离出来的一种可以将ACC分解成α-丁酮酸和氨的酶(Honma et a1.，1978；Penrose et a1.，2001)。 目前ACC脱氨酶已在部分微生物中得到了分离和纯化，其生化特性也己基本明确