转基因动物 生命科学前沿 教学课件.pptVIP

（六）显微注射法获得转基因鼠的成活率 优点： 转基因范围广，转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何 病毒基因组片段，绝对安全 。 缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不 表达；整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺 失等；需显微操作仪，技术性要求强。 二、胚胎干细胞方法 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞。 它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。 可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。 （一）ES细胞的建立与维持 动物的准备：取受精之后3.5天的母鼠分离鼠胚。 胚胎的分离和初培养：3.5天孕鼠 鼠断颈处死 解剖小鼠取出胚胎 体外培养胚胎 4—6天后，离散ICM。 ICM的离散与ES的分离：分离ICM 酶解细胞团 培养离散细胞 ES细胞集落 ES细胞的扩增：离散ES细胞 置四孔培养板中培养 ES细胞的常规培养：ES细胞由四孔板转至培养皿进行常规培养 阴拴（Plug） （二）ES细胞的基因组操作 将外源基因移入到ES细胞基因组后，既能高效稳定表达，又不影响ES细胞的各种功能。 这就要求目的基因必须要定点参入，并且参入整合后，对原有基因结构及功能没有影响或影响最小。 与整合位点两端区域同源的两段DNA序列（HB1和HB2） 转入的目的基因（TG） 编码抗G418的新霉素磷酸转移酶基因（neor） 两个不同的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2） （三）转基因ES细胞的筛选——正负选择法 正选择法筛选出转基因整合型ES细胞： 通过物理方法将重组DNA分子导入ES细胞，在含有抗菌素G418的培养基中，没有整合外源基因的细胞将全部死亡，只有整合了外源基因的细胞才可以存活下来。 负选择法筛选出特异整合型ES细胞： 如果非特异性整合发生，则两个tk基因或其中一个基因很大可能与TG和neor一起整合，这时用GCV筛选， tk基因表达的胸苷激酶能反GCV转化成有毒的化合物，使细胞死亡。这是负选反择。 （四）转基因ES细胞的检测 （五）转基因小鼠的繁育 正确整合的转基因胚胎干细胞经培养后就可以移入胚泡期的供体胚胎了。将这些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宫内，繁育转基因小鼠。 （六）获得纯合的转基因鼠 * * 转基因动物 将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行扩增和加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定整合人工导入外源基因的动物称为转基因动物（transgenetic animal）。 外源目的基因的制备 外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择携有目的基因的细胞 选择合适的宿主动物 转基因细胞胚胎发育及鉴定 筛选所得的转基因动物品系 第一节 目的基因的制备 来源 采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因； 通过mRNA合成cDNA； 人工合成的DNA片段； 聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段。 一、目的基因的制备 克隆 选择载体 目的基因与载体的连接 重组体导入受体细胞 二、目的基因的导入 电穿孔法 显微注射法 磷酸钙—DNA共沉淀法 脂质载体包埋法 病毒介导的生物学方法 电穿孔法 利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA转移至细胞中。此法简单、效率较高，广泛应用于培养细胞的基因导入。 磷酸钙—DNA共沉淀法 当核酸以磷酸钙—DNA共沉淀物的形式在时，细胞摄取DNA的能力显著加强。但转移效率较低，仅有1%~5%的外源DNA可以进入受体细胞核中，大约仅有1%的DNA可以在细胞中稳定表达。 脂质载体包埋法 将需要转移的外源DNA或RNA包裹于脂质体内，由于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，从而将外源DNA转入宿主细胞。这种方法转基因效率高。 逆转录病毒介导法 显微注射转基因技术 利用显微操作技术转移外源基因的方法。此法转入基因长度可达数百kb；并能随机地整合在受体细胞染色体DNA上，因此应用范围广。但是这种整合有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或定点突变。 何为显微注射？