组织化学技术 教学课件 原位杂交组织化学.pptVIP

原位杂交组织化学 ——组织化学和免疫细胞化学革命性的突破 原位杂交组织化学（In situ hybridization histochemistry，ISHH）是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统通过组织化学或免疫组织化学在核酸原有的位置进行细胞内定位。 应用：研究单一细胞中编码各种蛋白质，多 肽的相应mRNA 的定位，从分子水平 研究细胞内基因的表达及有关因素的 调控。主要用在细胞或组织的基因表 达，染色体分析，病毒诊断和发育生 物学。 一．概述 （一）核酸分子杂交技术 1961年Hall开始液相杂交技术—— 原理：碱基互补 20世纪70年代～80年代 1）分子克隆，质粒和噬菌体DNA构建成立。 2）诞生核酸自动合成仪。 3） 新杂交类型和方法： ① 固相杂交：一条在固体支持物，另一 条在液体内。 ② 液相杂交：双链游离于溶液 只能证 明该病原体，细胞或组织 中是否存在待测核酸。 固相杂交 a）菌落原位杂交（colony in situ hybridization ）—细菌裂解释放出DNA ，然后 进行杂交。 b）斑点杂交法（Dot blod ）—鉴定RNA c）Southern印迹杂交（Southern blod ） ——鉴定DNA中某一特定的基因片段。 d）Northern印迹杂交（Norther blod ） ——检测某一特定的RNA。 e）组织原位杂交（Tissue in situ hybr-idization）——不仅检测是否有核酸存在而且证明核酸基因分子在细胞组织中所在位置。 液相分子杂交技术 a）吸附杂交 b）发光液相杂交 c）液相夹心杂交 d）复性速率液相杂交 （见分 子生物学） （二）原位杂交的由来和发展 1969年．美国耶鲁大学Gall和Pardue用爪蟾核糖体基因与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞核。 Buongiorno—Nardelli和Amaldi，John等利用同位素标记核酸探针——细胞或组织的基因定位。 —— 原位杂交细胞或组织化学技术 1970年 Orth应用H标记兔乳头状瘤病毒cR- NA探针+兔乳头状瘤组织冰冻切片 →病毒DNA在细胞中定位 ※ 同位素标记缺点，污染环境，有害 人体，半衰期局限性 20世纪80年代 探索非放射性标记物 1981年Bauman利用荧光素标记c RNA 探针→原位杂交→荧光镜检成功。 1982年 Shroyer用2，4二硝基苯甲醛（DNP） 标记探针→DNA探针具有抗原性，然 后用兔抗DNP抗体识别杂交后探针→ 免疫过氧化物酶法定位杂交探针。 ※ 上述两种方法敏感度不高，应用不够普 遍。 1983年 Bridgat利用生物素标志探针在组织切片 上检测病毒DNA，通过生物素与抗生物 素结合，过氧化物酶—抗过氧化物酶显 示系统→显示病毒DNA在细胞中的定位。 1987年 Pezzella用磺基化DNA探针，以单 克隆抗体识别磺基化探针，通过 免疫组化显示结合的单克隆抗体 对杂交结合探针定位。 优点：探针标记简便，不需作切片平移标