第十五章 核酸的研究方法 生物化学与分子生物学教案.docVIP

第一节　核酸的分离、提纯和定量测定 一、DNA的分离 用1mol/L的NaCl制备组织匀浆，离心除去组织残渣，多次用苯酚（变性强烈）处理使蛋白质变性，每次处理后离心取上层水相，最后加2倍体积的乙醇沉淀出DNA。 二、RNA的分离 由于RNA酶存在广泛，且十分稳定，破碎细胞时要加入胍盐破坏RNA酶，试剂要用0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯）配制，器皿要高压灭菌或用0.1%的DEPC处理，多次用苯酚或氯仿处理使蛋白质变性，每次处理后离心取上层水相，mRNA可用寡聚dT-纤维素亲和层析从总RNA中分离。 三、核酸含量的测定法 常用的方法是测定260nm的消光度，用公式计算核酸的含量。 核酸的含量也可以用定磷法测定。 DNA的含量可以用二苯胺显色法测定。 RNA的含量可以用地衣酚显色法测定。 第二节　核酸的超速离心及核酸的凝胶电泳 一、核酸的超速离心 超速离心可以分离超螺旋DNA（密度大），线性DNA（密度小）和闭环DNA（密度居中）。也可以分离RNA。 二、核酸的凝胶电泳 从细菌抽提得到的质粒DNA 样品中不含线状DNA 第四节　聚合酶链反应（PCR） 一、PCR的定义 PCR(polymerase chain reaction)是应用最广的分子生物学技术之一，模板DNA的含量以指数方式增加，可用来快速在体外扩增DNA，PCR技术在临床检验和分子生物学中的应用十分广泛。耐热DNA聚合酶的发现推动了这一技术的广泛应用。 （二）复合PCR(multiplex PCR) 在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段的方法称复合PCR。复合PCR主要用于同一病原体分型及同时检测多种病原体。此外也常用于多点突变性分子病的诊断。 （三）不对称PCR(asymmetric PCR) 两种引物比例相差较大的PCR称不对称PCR。不对称PCR可制备用于核酸序列分析的单链DNA片段或核酸杂交的探针等。 （四）反转录PCR(reverse transcription PCR) 由于Taq酶只能以DNA为模板，当待扩增模板为RNA时，需先将其反转录为cDNA才能进行PCR扩增，这种PCR技术称为反转录PCR，在分子生物学和临床检验等领域均有广泛应用。 （五）涂片PCR(slide-PCR) 直接对载玻片上细胞涂片或组织切片进行PCR扩增的方法称涂片PCR。涂片PCR结合原位杂交技术特别适用于病理切片中含量较少的靶序列的PCR检测。 （六）反向PCR(inverse PCR) 扩增引物相反方向DNA序列的PCR技术称反向PCR。在反向PCR中，要先将含有一段已知序列的感兴趣的未知DNA片段进行酶切和环化，然后直接进行PCR，也可将已知序列酶切后再进行PCR。反向PCR主要用于已知序列两翼未知DNA序列的扩增。 （七）锚定PCR(anchored PCR) 用酶法在一通用引物反转录的cDNA 3′端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行PCR扩增称为锚定PCR，可用于未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。 （八）修饰引物PCR 为达到某些特殊应用目的如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等，可在引物的5′-末端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析物结合位点等，这种PCR技术称为修饰引物PCR。此外，还可将一些信号分子如荧光素、生物素等连接于引物的5′末端，当PCR完成后可对产物直接进行检测。 PCR在生命科学中的应用非常广泛，已有不少专著可供读者参考。