丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂.PPTVIP

实 验 二十二 改良Mohum法测定谷-丙转氨酶活性 一、实验目的： 　　　了解谷－丙转氨酶活性测定的原理及测定方法。 二、实验原理： 丙氨酸+α-酮戊二酸 谷氨酸+丙酮酸 在520nm波长测定其光密度，与经同样处理标准的丙酮酸 溶液比较，即可计算谷-丙转氨酶的活性。 血清谷-丙转氨酶活性单位定义： 在pH值7.4、 37℃条件下，每毫升血清与底物保温30min后，每生成2.5ug的丙酮酸作为1个谷-丙转氨酶的活性单位，正常值为2-40单位/ml。 三、实验步骤： 标准管法测定酶活性： 1、取干燥试管4支，标号 测定管 对照管 标准管 空白管 2、依次加入试剂，混匀，37℃保温 3、呈色反应后，520nm比色测OD值 四、结果： 谷丙转氨酶活性单位= （OD测定管-OD对照管）/OD标准管 ×标准管中丙酮酸含量×10/2.5 五、注意事项： 1 、保温温度和时间要精确，即谷丙转氨酶发挥催化作用环境 2 、掌握概念：酶活性单位 3、 微量移液器的使用 一、目的与要求： 了解琥珀酸脱氢酶的作用及酶促反应中的竞争性抑制作用 二、实验原理： 1、肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变为延胡索酸（三羧酸循环，线粒体）。 2、反应中生成的FADH2可使甲烯蓝还原为甲烯白。 3、丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，与琥珀酸的分子结构相似，与酶的亲合力高。丙二酸与酶结合后，酶活性受到抑制，则不能催化琥珀酸的脱氢反应。 4、本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔离空气条件下，以甲烯蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。 三、操作步骤： 1、酶提取液的制备 　1g 兔肌肉＋海砂（研磨） 　+12ml磷酸盐缓冲液（分三次加入，研成糊状） 　纱布过滤（双层） 四、结果： 五、注意事项： 充分碾磨家兔肌肉，碾磨器械、纱布要及时清洗，注意回收。海砂加入1/3匙，不可太多。 试剂滴加时，看清浓度，滴加液体石蜡时沿着管壁倾斜加入。 观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧化变蓝。 * * （Page 76） GPT 2、4-二硝基苯肼 NAOH 棕色丙酮酸二硝基苯腙 丙酮酸二硝基苯肼 P77页 分光光度计的使用 1、打开分光光度计，预热20-30min。 2、调节旋钮至需要的光波长。 3、检查拉杆是否在分光光度计的休息状态。 T档 拉杆0档 调T100% ： 空白管 T档 拉杆1档 调T 0% ： A档 拉杆2、3、4档 测吸光度： 标准管，测定管 休息状态：拉杆1档 实 验 七 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 （Page 40） FAD 抑制剂和底物的结构相似，能和底物竞争酶的活性中心，阻碍酶与底物结合形成中间产物。 ２、酶促反应及竞争抑制作用（滴） 　 取小试管五只，标记底物的多少，抑制剂的有无和多少 　 加石蜡隔绝空气，37℃水浴保温。　 无 有 有 有 有 酶 ５ ４ ３ ２ １ 结果 - 有 少 有 无 抑制剂 有 少 有 有 有 底物 管号