PCR课件 荧光PCR技术及其应用.pptVIP

目 录 PCR的反应原理 RT-PCR与荧光PCR的区别 荧光PCR实验设计 PCR 反应原理 RT-PCR与荧光定量PCR的区别 原理：引入了C(t)值，C(t)值与起始模板浓度的对数成反比 什么是C(t)值 荧光PCR反应步骤与产物定量 1) 反应体系： 在RT-PCR 反应体系中增加荧光染料。 2) 定量方法(绝对定量) 3） 相对定量（引入看家基因，比较ct值） 荧光PCR的试验设计 4. RNA质量检测 琼脂糖凝胶电泳 测A260/A280，要求1.80 OD260/OD280测定 1.8-2.0时，RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍 R1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显 R2.2时，说明RNA已经水解成单核酸 注： OD260/OD280比值与DEPC水的PH有关，电泳结果更可靠！ 5. 注意事项 RNA酶非常稳定，抽提时需防止RNA酶污染！ 尽可能在无RNA酶的环境下操作，戴手套，口罩！ 实验材料的处理： 研钵在200℃烤箱中烤10h以上。 枪头和eppendorf管DEPC水浸泡后灭菌处理 逆转录第一步结束后需要立即冰浴。 二、引物设计与合成 常用引物软件 引物设计原则 设计步骤 引物分析 引物合成 1. 引物设计软件 基因序列同源性比对 DAMAN 引物有哪些信誉好的足球投注网站：Primer Premier 5.0 引物评价：Oligo 6.22 3. 设计步骤示例 GeneBank查找目的基因/ DAMAN 比对同源序列 Prime 软件检索较佳的引物上下游 合成引物 2. 设定反应孔，荧光染料，PCR 反应程序 反应孔设置(unknown,calibrater,NTC,standard) 荧光染料选择（ROX,SYBR-Green） 设定PCR反应程序 预变性（94~95℃,5~10min） 变性（93~94℃,20s~30s） 退火（50~60℃,20s~60s） 延伸（70~75℃,30s~1min） 3. 数据的定量分析示例 定量方法的选择 绝对定量（制备标准品） 相对定量 （选定与目的基因扩增效率一致的看家基因） 结果分析见示例！ 对照组：用作对照的样本，与实验组进行比较 实验组：未知样本，用于研究 目的基因(GOI)：用于研究的基因 内参基因(看家基因)：基因表达量比较恒定的基因，用于校正起始上样量的区别 参比样本(Calibrator): 用于比较的样本，如未处理样本、正常组织、0时相样本等 标准品(Standards)：梯度稀释的已知浓度的样品，测定未知样品的浓度和反应效率 Ct值： 样品扩增产物的荧光信号达到所设定的荧光阈值时需要的循环数 反应效率(E)：PCR扩增的速率 几个概念 荧光PCR实验设计 总RNA 提取 cDNA模板制备 荧光PCR扩增反应 引物设计与优化 查找目的 基因序列 反转录 软件 Taq酶/dNTP /Mg2+/buffer PCR反应条件优化 梯度PCR仪 荧光PCR仪 1. 样本的准备(防止RNA 降解) ? 速度 ? RNA酶抑制剂 ? 保存条件(液氮速冻，－80℃保存) 2. RNA 提取步骤 ? 组织研磨后用Trizol裂解 加氯仿萃取分层 异丙醇沉淀RNA 75%乙醇洗沉淀 DEPC水溶解RNA 1％琼脂糖电泳检测RNA质量（两条带！）。 一、模板的制备 3. 逆转录： 试剂 ?逆转录引物 随机六核苷酸引物(总RNA) 或者OligodT 引物(mRNA) ?逆转录酶 AMLV, MMLV ? d NTP ? RNA 酶抑制剂 步骤 ? 核酸蛋白仪检测RNA浓度（5ul+95ul水），根据260/280检测RNA纯度，同时定量RNA。 ?取2ug RNA+OligodT 5ul+水至13ul体系，70℃ 5分钟后冰浴。 ?加入M-MLV(1ul), 5*M-MLV(5ul), d NTP(5ul), RNA 抑制剂 (1ul), 共12ul体系于反应管中，42℃ 60分钟，4℃保存。 电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好的。 28S 18S 5S 扩增产物 ? 产物短，反应效率高，但易产生非特异性条带。理想状态为150–200 bp。 ? 避开G/C含量较高的序列 引物 ? 避免二级结构(发卡) ? 避免出现4个连续相同的碱基(尤其是G) ? 长度18–25 bp ? 3‘端尽量