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Wnt信号激活剂氯化锂抑制脂肪细胞分化的研究 　　【摘要】目的证实Wnt信号激活剂（氯化锂）可以抑制骨髓基质干细胞（BMSCs）向脂肪细胞分化的作用。方法体外培养Balb/c小鼠骨髓基质细胞并诱导其向脂肪细胞分化，再用Wnt信号激活剂氯化锂干预，用油红O染色观察脂肪细胞的形成，RT-PCR检测骨髓基质细胞中脂肪细胞PPAR-γ和成骨细胞Runx-2相关基因的表达。结论Wnt信号激活剂氯化锂可以抑制骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化。 　　【关键词】Wnt信号激活剂；氯化锂；基质干细胞 　　062文章编号：1004-7484（2014）-06-3056-02 　　有研究证实Wnt信号可以抑制基质干细胞向脂肪细胞分化，促进其向成骨细胞分化。经典Wnt信号通路是Wnt蛋白可以结合Frizzled受体家族。这些受体的活化使通路中的关键蛋白β-连环蛋白（β-catenin）在胞浆中稳定并累积，然后进入胞核与TCF/Lef转录因子结合，从而诱导Wnt靶基因的转录。通常，在没有Wnt信号的情况下，β-catenin不断地被降解复合物（APC/Axin/GSK-3β）中的GSK-3β在其氨基末端磷酸化，从而被蛋白酶降解。这样，可以通过抑制GSK-3β使β-catenin在胞浆中积聚从而间接达到Wnt信号活化效应。所以本试验选择了GSK-3β的抑制剂氯化锂（LiCl）来进行研究。又因为再障是一种器官特异性的自身免疫性疾病，环孢素A作为非细胞特异性的免疫抑制剂，是临床治疗再障的基本药物。该实验为氯化锂联合环孢素A治疗再障提供理论基础，以达到更好的临床治疗效果。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料动物：雌性Balb/c小鼠（H-2d）8-12周龄，18-22克，由武汉大学实验动物中心提供。 　　1.2药品及试剂氯化锂、地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）均购自美国Sigma公司，胰酶粉剂、油红O购自美国Amerisco公司，标准胎牛血清为杭州四季青公司产品，RT-PCR试剂、TRIzol试剂购自TaKaRa公司。L-DMEM培养基为美国HyClone-Pierce公司产品。 　　1.3试剂配制油红O染液的配制：油红O干粉0.4g加入10mL异丙醇充分溶解，干液室温保存。干液和三蒸水以3：2比例混合，过滤、取滤液作为新鲜染液。脂肪细胞分化培养基1：10ml胎牛血清、1mg胰岛素、0.1μmol地塞米松、0.05mmolIBMX、90mlL-DMEM。脂肪细胞分化培养基2：10ml胎牛血清、1mg胰岛素、90mlL-DMEM。红细胞裂解液（Tris-NH4Cl）：NH4Cl3.735g加上450ml双蒸水，Tris碱1.0297g加上50ml双蒸水，两者混匀，过滤除菌，待用。 　　1.4方法 　　1.4.1正常小鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）的培养正常小鼠拉颈处死，无菌取下股骨和胫骨，机械分离血管结缔组织，PBS冲洗，用针头在生长端打孔，注射器将骨髓细胞吹入无血清DMEM培养基中并反复吸冲成单细胞悬液，离心1500r/min×10min。细胞沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬后以20×107/瓶密度接种于100cm2培养瓶中。72h后首次半量换液，以后每3-4天换液一次。11d左右BMSCs约80%汇合，室温条件下用0.25%的胰蛋白酶和0.02%EDTA按1：1混合消化分离细胞并传代。 　　1.4.2定向诱导BMSCs向脂肪细胞分化第二继代细胞以每毫升5×104个接种于6个培养皿中，分为对照组，脂肪细胞组和Licl抑制组。细胞达到80%汇合后对照组继续加常规培养液，脂肪细胞组换成脂肪细胞分化培养基1，Licl抑制组换为脂肪细胞分化培养基1并加入LiCl使其终浓度为20mmol/L。两天后换液，对照组继续加常规培养液，脂肪细胞组换为脂肪细胞分化培养基2，Licl抑制组换为脂肪细胞分化培养基2再加LiCl使其终浓度为20mmol/L。两天后，均换为常规培养液。于培养的第14天将各组细胞做油红O染色，并取各组细胞约107个，各加入1mlTRIzol用于做RT-PCR。 　　1.4.3脂肪细胞的检测每日通过倒置显微镜观察诱导分化的细胞，待分化后的脂肪细胞中脂肪颗粒较多较大时，即大约诱导分化的第14天左右，用油红O染色，检测脂肪细胞的数量，具体方法为：各组细胞用PBS冲洗3次，10%中性甲醛固定10min，油红O染液浸染10min，60%异丙醇洗去多余染液，PBS冲洗3次，苏木精复染3-5min，1%盐酸稍分化，PBS漂洗10min，显微镜下观察。 　　1.4.4RT-PCR检测PPAR-γ和Runx-2的半定量表达将各组细胞中的培养液倒掉，各加入1mlTRIzol，吹打混匀后，各移入1.5ml的Eppend