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放射免疫技术 放射免疫技术（radioimmunoassay,RIA）是以放射性核素为示踪物的标记免疫分析技术。 常用于定量测定受检样本中的微量物质，在内分泌学、免疫学、药物学、微生物学、生物化学等多个领域得到广泛应用。 但是放射免疫技术总是伴有不同程度放射性污染，目前有逐渐被其他免疫学标记技术所取代的趋势。 放射免疫技术类型主要包括: 放射免疫分析 (radioimmunoassay, RIA) 免疫放射分析或免疫放射度量分析(immunoradiometric assay，IRMA) 放射免疫分析(RIA) 是以放射性核素标记抗原和待测抗原竞争结合一定量的特异性抗体，来测定待测抗原含量的一种竞争免疫学方法。即经典的RIA法。 是目前应用最广的放射免疫技术。 免疫放射分析(IRMA) 又称免疫放射度量分析，是以放射性核素标记的抗体与待测抗原发生非竞争性结合反应，来测定待测抗原含量的一种非竞争免疫学方法。 一、放射性核素标记物的制备 放射性核素标记物是指放射性核素标记在目的抗原或抗体上所形成的放射性标记抗原或抗体，是放射免疫技术试剂盒主要组成成份。 （一）放射性核素 放射性核素是指原子核能自发地产生成分或能级的变化，然后变成另一种核素，变化时伴有射线的发射。 其放射量单位有: ①放射性活度 ②放射性比活度 ③放射性浓度 ①放射性活度——单位时间内的核衰变数，即每秒衰变次数，用贝可勒尔(Becquerel，Bq)表示 1Ci=3.7×1010Bq ②放射性比活度——是指单位质量样品中所含放射性活度，以Bq/g或Bq/mmol表示 ③放射性浓度——是指单位体积溶液中所含放射性活度，以Bq/ml表示。 放射性核素类别 依衰变方式分α、β、γ三种，用于放射性标记的有β和γ两类;分别用液体闪烁计数器及γ计数器测定。 目前常用的是γ型放射性核素，如125I、131I、51Cr和60Co，以125I最常用；β型放射性核素有3H、14C和32P，以3H最常用。 现以125I和3H为例比较两者的特点(表19-1)。 表19-1 125I和3H标记物特点比较 放射性核素选择原则 高比活度、适宜半衰期、对抗原或抗体没损害并且容易标记。 125I最接近理想条件，其比活度为6.438×1014Bq/g，而14C的最大比活度为16.65×1010 Bq/g，如果标记量相同，125I敏感度比14C大3900倍。 (二) 抗原或抗体 用于放射性标记的抗原或抗体的质量直接影响分析的灵敏度和特异性; 用于标记的抗原要求纯度高，并具有足够或完整的免疫活性； 用于标记的抗体应具有高亲和常数、交叉反应率低、抗体滴度高。 （三）放射性核素标记物的制备 RIA和IRMA 分别以放射性核素标记抗原和放射性核素标记抗体检测抗原。 以放射性核素125I标记抗原为例说明标记物制备。 1．直接标记法 是将125I直接结合在蛋白质侧链的酪氨酸残基苯环上，形成单碘酪氨酸或双碘酪氨酸。操作简便，结合效率高，但只能标记含酪氨酸的化合物，有时可能会损害蛋白质的活性。 2.间接标记法 亦称联结标记法。这种方法是先将放射性碘连接到一个小分子载体上，再将这个小分子载体与蛋白质结合。 具有代表性的方法是Bolton-Hunter法，使用的载体分子是N-琥珀酰亚胺3-(4-羟基苯)-丙酸(SHPP)。标记方法分两步进行，第一步是先用氯胺T法使SHPP碘化，第二步再将碘化SHPP分子偶联到蛋白质分子上。 (四) 放射性标记物的纯化与鉴定 1.放射性标记物纯化 可用葡聚糖凝胶过滤法或薄层层析法、纸层析法、电泳法、高效液相层析法等。 2.放射性标记物的鉴定 理想的放射性标记物是高放射化学纯度、适当的比放射性和免疫活性。 (1) 放射化学纯度 是指结合于抗原上的放射强度占总放射强度的百分率;即碘化蛋白峰的放射强度占总放射强度的百分率。 影响因素: ①被标记物不纯，杂质也被放射性核素标记； ②标记后的分离纯化不完全； ③标记化合物贮存过程中的碘脱落。 (2) 比放射性 或称放射性比度,是单位质量标记物的放射强度，单位为Bq/?g。标记抗原的比放射性越高，所需标记抗原量越少，实验系统的敏感度越高。 但过高的比放射性可能会损伤抗原的免疫活性。如碘标记化合物以单碘标记为宜。 (3) 免疫活性 是指标记抗原结合于抗体的放射强度占总放射强度的百分率。以检查标记后免疫活性损失情况。 方法是加10倍量抗体和标记抗原反应，测定结合部分(B)和游离部分(F)的放射强度，算出B/B+F的百分率，正常应在80%以上，值越大，说明抗原损伤越少;如果值过小，标记抗原应重新强化或废弃重做。 二、抗体选用 抗体也是放射免疫技术试剂盒主要组成试剂之一，常采用含特异性抗体