玉米叶片DNA快速提取方法的研究.pdfVIP

基因育蛋白质工程 玉米叶片DNA 快速提取方法的研究和比较 杭颖颖 3120100281 一、 实验原理和目的 PCR 技术是检测、筛选转基因玉米的重要手段，因此提供高质量的满足检测需求的 基因组DNA 是十分必要的。目前，高质量的基因组DNA 提取方法主要有CTAB 法、 SDS 法、离心柱提取试剂盒法和磁珠提取试剂盒法 。但是前2 种方法费时费力，后2 种方法费用较高 ，都难以适用于转基因植株检测时大批量提取基因组DNA 的要求。 通过改良CTAB 方法快速提取DNA （二步CTAB 法），并与试剂盒提取进行对比，从而检 测该方法的有效性。 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持 物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。 琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受 到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量， 而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相比于蛋白质太 小，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。 蛋白质和核酸会根据pH 不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速 度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH 在6~9 之间，离子强度 0.02~0.05 为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp 的DNA 片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼 脂糖凝胶分离DNA 的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp 的DNA 片 段。 二、 实验材料和器材 【实验材料】 玉米幼嫩叶片 【实验试剂】 CTAB 提取液（(CTAB 4 g，NaC1 16.364 g，1 mol/L Tris-HC1 20 ml(pH8.0) ，0.5 mol/ L EDTA 8 m1，先用70 ml ddH20 溶解，再定容至200 ml 灭菌） 氯仿/异戊醇(24：1) 冰异丙醇 ddH2O Rnase A 酶 （10mg/ml） 6 ×loading buffer 1×TAE DNA Maker 琼脂糖凝胶 溴化乙锭 植物DNA 提取试剂盒 （根据实验室情况而定） 【实验仪器】 PCR 仪 水浴锅 离心机 基因育蛋白质工程 凝胶成像仪 电泳仪，水平电泳槽，梳子，托盘，胶托 移液枪 锥形瓶若干 三、 实验内容和步骤 1. DNA 提取 1.1 二步CTAB 法提取DNA 1.1.1 取50-100mg 玉米幼嫩叶片，放入1.5ml EP 管中。将EP 管放入液氮中2-5min，用在 液氮中快速冷却过的玻璃棒将叶片研磨成粉末。 1.1.2 加入500ulCTAB 提取液，65℃水浴10min。 1.1.3 在水浴后的EP 管中加入500ul 氯仿/异戊醇 （24:1），震荡混合后，12000 r/min 离心 5min，取上清液于1.5mlEP 管中 1.1.4 加入0.7 倍体积上清的冰异丙醇，沉淀DNA。 1.1.5 12000 r/min 离心3 分钟，弃上清，加入500ul70%乙醇洗涤后12000 r/min 离心 2min，弃上清，离心管开口朝下放置，室温晾干 1.2 试剂盒法提取DNA 按照说明书进行操作，溶解在100uL ddH2O 中 2. 琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 完整性 2.1 加入50uL ddH2O 溶解DNA 后加入0.5uL RNase A 酶 （10mg/ml）置于37 摄氏度 水浴 锅中30min。取5uL 提取的DNA，加入1uL6 ×loading buffer，1% 的琼脂糖凝胶电泳，溴化 乙锭染色，在凝胶成像仪上观察成像 【凝胶电泳操作步骤】 1) 器具清洗：自来水清洗三次，纯水清洗三次，用纸巾擦干 2) 配胶：配置1% 的琼脂糖凝胶，将锥形瓶洗净加入少量纯水煮沸，量取一定量的 1xTAE ，称取相应量的琼脂糖倒入锥形瓶中，用锡纸封口，放入微波炉中加热，防止爆 沸。将煮好的凝胶冷却到60℃左右，将琼脂糖溶液轻轻倒在电泳槽水平板上。待凝胶 冷却后，在电泳槽中加入电泳缓冲液，拔出梳子，注意