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徐瑞阳P53蛋白在pET-30A载体上的表达 徐瑞阳 应用生物科学3120100346 实验目的： p53是一种肿瘤抑制基因，在所有恶性肿瘤中，50%会出现该基因的突变。该基因编码的蛋白质是一种转录因子，分子量为53kDa，它控制着细胞周期的启动，很多与细胞健康有关的信号都由p53蛋白发送。 P53有多种生理功能，主要是以下三个：促进细胞凋亡；阻滞细胞周期；维持基因组稳定性（DNA修复）。 因此本次实验的目的是利用pET-30A载体将斑马鱼基因组中的p53基因表达，并在实验条件允许的情况下进行目的蛋白的一系列功能鉴定。 实验原理； 以pET-30A作为载体，利用限制性内切酶将载体与目的基因酶切，再将之连接构建成表达载体。将构建好的表达载体转化大肠杆菌菌株接种到培养基上培养，利用卡那霉素筛选出成功导入目的基因的菌株，再培养并诱导表达目的基因。最后提取出目的蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及功能的鉴定。 实验步骤： 1、查找目的基因p53：在Pubmed上查找到斑马鱼p53基因的外显子序列atggcgcaaaacgacagccaagagttcgcggagctctgggagaagaatttgattattcagcccccaggtggtggctcttgctgggacatcattaatgatgaggagtacttgccgggatcgtttgaccccaatttttttgaaaatgtgcttgaagaacagcctcagccatccactctcccaccaacatccactgttccggagacaagcgactatcccggcgatcatggatttaggctcaggttcccgcagtctggcacagcaaaatctgtaacttgcacttattcaccggacctgaataaactcttctgtcagctggcaaaaacttgccccgttcaaatggtggtggacgttgcccctccacagggctccgtggttcgagccactgccatctataagaagtccgagcatgtggctgaagtggtccgcagatgcccccatcatgagcgaaccccggatggagataacttggcgcctgctggtcatttgataagagtggagggcaatcagcgagcaaattacagggaagataacatcactttaaggcatagtgtttttgtcccatatgaagcaccacagcttggtgctgaatggacaactgtgctactaaactacatgtgcaatagcagctgcatgggggggatgaaccgcaggcccatcctcacaatcatcactctggagactcaggaaggtcagttgctgggccggaggtcttttgaggtgcgtgtgtgtgcatgtccaggcagagacaggaaaactgaggagagcaacttcaagaaagaccaagagaccaaaaccatggccaaaaccaccactgggaccaaacgtagtttggtgaaagaatcttcttcagctacattacgacctgaggggagcaaaaaggccaagggctccagcagcgatgaggagatctttaccctgcaggtgaggggcagggagcgttatgaaattttaaagaaattgaacgacagtctggagttaagtgatgtggtgcctgcctcagatgctgaaaagtatcgtcagaaattcatgacaaaaaacaaaaaagagaatcgtgaatcatctgagcccaaacagggaaagaagctgatggtgaaggacgaaggaagaagcgactctgattaa 2、设计引物： 根据Pubmed查到的上斑马鱼p53基因外显子序列，我设计了正向反向两个引物。 Forward: atcgggatccGCCACCatggcgcaaaacgac 其中前四位碱基”atcg”为保护碱基；”ggatcc”为BamHI酶的特异性识别序列；GCCACC为增加基因翻译效率的KOZAK序列； Reverse：atgcctcgagttaatcagagtcgct 其中前四位碱基”atgc”为保护碱基；“ctcgag”为XhoI酶的特异性识别序列； 3、RT—PCR扩增p53基因编码区： 取斑马鱼胚胎100枚,加入l mL TRIzol试剂,按说明书操作 提取总RNA。以Oligo(dT)为引物,参照TaKaRa 公司M·MLV反转录酶试剂盒说明,反转录生成cDNA。这样得到的cDNA第一链作为模板,进行PCR 扩增。PCR反应程序:94°C 5 min; 94°C 30 s, 56°C 30s, 72°C 1min, 30