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DNA转化实验 应用生物科学 沈毅 【摘要】 DNA转化是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。本实验以E.coli DH5Α菌株为受体细胞,CaCl2处理,使其处于感受态,pUC-19质粒共保温,实现转化。pUC-19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过在培养基中加入氨苄青霉素，利用Amp抗性来筛选转化子。同时，蓝白斑法对能够产生β-半乳糖苷酶的转化子进行筛选，最终成功得到了预期的实验组蓝色菌落、对照组无任何菌落的结果。 一、实验目的 CaCl2法将载体(质粒)转化入受体 (大肠杆菌)的实验技术 二、实验原理 1、转化：在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,转移所必需的mob,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA转化即是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbClKCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(带有异源DNA分子的受体细胞) 本实验中，采用较为简便易行的感受态细胞获得办法CaCl2法，用蓝白斑筛选法筛选转化子。 2、载体pUC-19质粒带有氨苄青霉素抗性基因，而宿主菌DH5Α对氨苄青霉素没有抗性。pUC-19质粒转化DH5Α 后，涂布到含有氨苄青霉素的培养基上培养，没有被转化的菌不能生长，而被转化了的菌可以正常生长，形成菌落。 3-互补：pUC-19质粒带有一个大肠杆菌DNA的短区段, -半乳糖苷酶基因（Lac Z）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。 DH5Α 宿主菌染色体上带有Lac ZC端部分编码信息，它们编码的肽段各自都不具有酶活性, 但它们在同一细胞内可以通过非共价键结合起来, -半乳糖苷酶活性的蛋白质。质粒载体与Lac Z基因上缺失近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的大肠杆菌突变体之间的这种互补作用就称为α-互补。 4、如图一， IPTG是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质。基于这个特性，当pUC系列的载体DNA（或其他带有lacZ 基因载体DNAlacZ 缺失细胞为宿主进行转化时，如果在平板培养基中加入XGal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落而方便地挑选出基因重组体。此外，它还可以作为具有lactac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。如图二，只有成功进行了载体与受体α-互补之后的细菌，才能产生具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质，将乳糖转化为半乳糖和葡萄糖，即使底物X-gal变为蓝色；而未能将质粒DNA成功导入的细菌则不能形-半乳糖苷酶，实现了蓝白斑筛选。 三、实验材料 1、试剂 药品准备：蛋白胨、酵母粉、NaCl、琼脂、NaOH-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG5-溴-4-氯-3-吲哚--D-硫代半乳糖苷（X-gal0.1mol/L CaCl2、氨苄青霉素 LB固体培养基（80mL=0.8g蛋白胨+0.4g+0.8gNaCl+1.2g琼脂（1.5%+80mL蒸馏水，NaOH调pH7.0 2、仪器：高压灭菌锅、恒温培养箱、台式离心机、超净工作台、恒温水浴锅 3大肠杆菌DH5Α（受体）、质粒pUC19 Vector（载体） 四、实验步骤 1、制备感受态细胞 制作选择平板：LB固体培养基后，高压灭菌并冷却到50C。加入氨苄青霉素母液（500mg/mL9.6μL,使其终浓度为60g/mL,倒两个平板。在超净工作台上，分别在两个平板的培养基表面涂布40LX-gal和8μLIPTG溶液，室温下放置34小时。 将培养好的20mL大肠杆菌DH5Α转移到一个无菌离心管中，冰上静止放置10分钟，是培养物冷却到0C。 ⑶以4000r/min离心10分钟，回收细胞，弃上清，将管倒置使残留的痕量培养液尽量流尽；1.5ml冰冷的0.1mol/L CaCl2悬浮沉淀。 2000r／min离心10分钟，回收细胞且使培养液流尽。 1ml冰冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，将细胞分成200L一份，装入Eppendorf此时的细胞为感受态细胞。 2、细胞转化 2管200μL的感受态细胞，12μL的pUC-19 DNA