细胞凋亡概念.PPTVIP

第十三章  细 胞 凋 亡 及 基 因 调 控 一、细胞凋亡概念 细胞凋亡（Apoptosis）又称程序性细胞死亡（Programmed cell death简称PCD），是由基因编程控制的细胞主动参与的自杀过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一种生理性调节机制，在机体中承担着重要的调控作用。 细胞凋亡与细胞坏死的机制不同（如图13-1） 细胞凋亡与细胞坏死的区别(表13-1) 二、细胞凋亡的特征 1、形态学变化：胞核染色质固缩，集聚核周遍呈月斑块?浓缩、断裂；胞膜表面泡状突起出芽；细胞体积缩小，园缩，内馅，分割成大小不等膜包凋亡小体。凋亡小体内有完整的细胞器和核物质 （用电镜可以检测凋亡小体）（如图13-2）。 2、细胞凋亡的生化过程： 细胞基因组DNA的降解：（内源性核酸内切酶的激 活）?切割成180~20bp的整数倍核小体片段，电泳可呈梯形条带（DNA ladder） （如图13-3） 。 内核断裂：经DAPI即4-6-二脒基二苯基吲哚荧光染色，可见颗粒状的荧光碎片（核内）；在流式细胞检测细胞周期时可测出亚G1峰，称“G1”期的AP峰（即凋亡峰） （如图13-4） 。 三、细胞凋亡的常见因素 细胞凋亡是一种复杂的生理生化过程，可受多种因素的影响，均受基因调控，同时也受环境中的各种理化因子和药物调节。 1、诱导细胞凋亡的诱导因子（表13-2） 2、细胞因子去处后的细胞凋亡（表13-3） 已报道的诱导凋亡的物质（表13-4） 抑制细胞凋亡的物质（表13-5） 四 、细胞凋亡的基因调控 蝌蚪变成青蛙尾巴消失；胸腺细胞选择性死亡所导致的细胞凋亡都受某些基因的活化、表达和调控。决定细胞死亡的基因称“细胞死亡基因”，反之，抑制细胞凋亡的基因称存活基因，其也受许多基因的控制（表13-6） 抗凋亡基因活化表达?肿瘤发生恶化 若抑制表达?肿瘤生长下降，药效好，预后佳 凋亡/促凋亡基因受抑/缺失?肿瘤耐药，预后不良；凋亡/促凋亡基因激活?肿瘤生长下降 1、Ced基因家族 （1）Ced –3,ced-4?与细胞凋亡有关。与钙离子结合蛋白和丝氨酸/磷酸化有关。 （2）ced –9?抑制细胞凋亡。通过Ced –3,ced-4发挥作用。 （3）其他Ced 1、6、7、8、10、2、5、参与对凋亡细胞吞噬清除。 2、Bcl-2基因家族； （1） Bcl-2基因：抑制细胞凋亡?肿瘤发生 （2） Bcl-x基因:Bcl-xl同Bcl-2抑制凋亡；Bcl-xs相反，促进细胞凋亡?肿瘤生长下降（3）Bax基因：加速细胞凋亡?肿瘤生长下降 Bcl-2\Bcl-x\Bax三者形成一个凋亡调控系统。（如图13-5） 3、ICE家族 （1）ICE来源于单核细胞可作用于IL-1 β前体，使之成熟，过量表达会导致细胞凋亡。 Caspase结构域和活化 Caspase的N端为半胱氨酸蛋白酶募集域(CARD),并有P环(dATP)的结合点,后接20KD的P20区域,内含QACRG活性中心,最后为10KD的P10长羧基末端。 当Caspase在20～10KD（P20 ～P10）之间断开，并形成四聚体后才具有酶的活性，而使细胞凋亡。（如图13-6） Caspase激活途径 A 死亡途径：当膜表面Fas、TNF-a、TRAIL受体与相应配体结合，使Fas相关死亡结构域（FADD）活化，激活Caspase-8/10，进一步激活Caspase6/7,继而激活Caspase-3引起凋亡，同时受ICE抑制物（CrmA)及凋亡抑制蛋白负调控。 B 线粒体途径：当细胞应激因子促使细胞色素凋亡交互因子（CIFA）进入线粒体，引起细胞色素c分解释放至胞质中，通过P环激活Caspase-9，继而激活Caspase-3引起凋亡，并同时受到bcl-2/bax调控。（如图13-7） （2）Caspase-3又称Cpp32/Yama/Apopain可作用于多聚ADP核糖多聚酶PARP 使之降解为89KD和24KD，破坏PARP修复DNA功能，引起凋亡。 （如图13-8） （3）颗粒酶有A和B两种颗粒酶A是丝氨酸蛋白酶，颗粒酶B可催化IL-1 β前体成熟，而导致凋亡。 4、其它基因和蛋白：P53、C-myc、Fas/Apo-1（表13-6） 五、细胞凋亡常用的检测技术 （一）光镜的形态学观察： 普通光镜：细胞园缩，核浓缩、破碎 透射光镜：凋亡小体 （二）细胞DNA提取物的核酸电泳： 电泳后经过溴乙锭染色，在紫外光下呈梯形条带。 （三）MTT法：细胞凋亡，细胞琥珀酸脱氢酶下降，经过MTT呈兰紫色颗粒下降，经过酸化异丙醇溶解后，于490nm波长下测OD值，计算IC50。 抑制率（%）=（1-试验组平均A值/阴性对照组平均A值）×100%。 (四)荧光法：断裂DNA可被DAPI着色后形成核