中草药膜荚黄芪根部多糖免疫受体研究.ppt

文献翻译 妍妍 中草药膜荚黄芪根部多糖免疫受体研究 摘要：草药膜荚黄芪根部的免疫增强作用与它的多糖部分，即黄芪多糖（APS）密切相关,我们再此通过检测细胞增殖和细胞因子产量证明APS能激活鼠的B细胞和巨噬细胞，而不能激活T细胞。通过流式细胞检测分析及共聚焦激光扫描显微镜检测发现，荧光标记的APS（FL-APS）能够选择性侵染鼠的B细胞、巨噬细胞及人的肿瘤细胞系THP-1(单核白血病细胞)。这种与B细胞、巨噬细胞特异性的结合可被细菌脂多糖（LPS）竞争性地抑制。兔抗鼠免疫球蛋白抗体（Ig）能够抑制APS诱导的B细胞增殖和APS与B细胞结合。此外， APS能够有效刺激C3H/HeJ小鼠（其TLR4分子突变而无信号传导能力）脾脏B细胞增殖 ，上述结果表明，APS通过细胞表面不依赖TLR4而是通过免疫球蛋白来激活B细胞。有趣的是，APS对 C3H/HeJ小鼠巨噬细胞的刺激无反应，说明APS介导的激活巨噬细胞作用与TLR4密切相关。抗鼠TLR4单克隆抗体能够部分抑制APS与巨噬细胞的结合，提示APS与细胞表面的TLR4具有直接的相互作用。这些结果从分子水平揭示APS免疫作用机理。 材料和方法 动物和抗体 1、动物和抗体 试验动物：雌性BALB / c小鼠，购自北京大学健康科学实验动物中心；雌性C3H/HeJ小鼠，购自中国科学院上海实验动物中心。所有的动物均饲养于免疫教研室。 抗体：抗鼠TLR4或RP105单克隆抗体，购自Invivogen公司；鼠抗人CD14单克隆抗体购自R＆D公司；兔抗鼠多抗和未免疫的兔或鼠IgG由本实验室制备。 2、黄芪多糖的制备 黄芪根切片，用沸水萃取三次。上清液加到用0-2 mol / L氯化钠线性梯度洗脱的DEAE-Sephacel中。碳水化合物组分浓度的测定采用苯酚 - 硫酸法。碳水化合物各组分混合，并且沉淀用酒精洗三次。产生的多糖提取物是针对水的几个变化透析的，然后冷冻干燥。最终产品的碳水化合物的含量为97％，提取的蛋白质和核酸污染可以忽略不计（在280和260nm处的吸光度值接近于零）。用凝胶过滤法测定提取物的分子量大约3500~1.58*10^6 。应用薄层色谱法和气相色谱分析糖成分表明，鼠李糖，木糖，葡萄糖，半乳糖，人，和FRU与鼠李糖：木糖：葡萄糖：半乳糖：人的摩尔比为：FRU?4.9:4.7:8.3:122.2:2.2:3.1。 3、细胞培养液 所有的细胞在R10的RPMI-1640培养液中培养（Hyclone公司），并添加10％（V / V）FCS（Hyclone公司）、青霉素/链霉素（100 U / ml）、L-谷氨酰胺（2mM）、和2-ME(5*10^5 M)。肿瘤细胞系的Raji细胞，THP-1，CCRF-CEM，来自于美国的ATCC，并在其实验室保存。 4、荧光标记的APS和葡聚糖的制备 基本上与Glabe 所描述的情况一致。简言之，APS或葡聚糖（分子量70,000，Sigma公司）的溶液（20mg/ml）与0.2毫克溴化氢（50mg/ml）和0.2M氢氧化钠混合，在PH11时磁力搅拌15分钟。在pH8.0时对钠硼酸盐缓冲液透析后20小时，经溴化氰活化的APS或葡聚糖与2mg荧光素胺（Sigma公司）体积小于4毫升混合10小时。合成的荧光标记的多糖经葡聚糖凝胶G-50（Pharmacia公司）的凝胶过滤柱（2*40厘米）与无荧光素胺分离。收集洗脱组分（3毫升/管）并且在440nm处波长处测荧光素胺的浓度。用含荧光素胺的梯度稀释液(从 2 到 200μM)制备标准曲线。用稀释后的葡聚糖构建标准曲线。 5、小鼠脾脏T细胞，B细胞，贴壁细胞和腹膜巨噬细胞的准备 BALB / c或C3H/HeJ小鼠的脾脏，轻轻按在不锈钢筛（200目）上用注射器柱塞捣碎。红细胞用蒸馏水短时间处理裂解，脾细胞洗涤两次，使之在完全R10中悬浮。 新鲜配制的、应用R10重悬为10^7个/ ml的BALB/c小鼠脾细胞接种到90毫米组织培养皿中，37℃、二氧化碳培养箱中培养4小时。收集没贴壁细胞用PBS洗两次，然后将涂有磁珠的CD19（B细胞表面抗原）大鼠抗小鼠的单克隆抗体，（Myltenyi BIOTEC）在密度为10μg抗体/10^7脾细胞中4℃培养30分钟。标记的细胞用PBS洗两次，然后用于磁珠分离柱，流出的非B细胞被收集。经过进一步清洗，移去磁选机，B细胞用柱塞冲洗。为了增加非B细胞内T细胞的纯度，重新用分离柱分离并收集T细胞（流出物）。B细胞与带有FITC标记的抗鼠免疫球蛋白抗体（IgG）、T细胞与带有的FITC标记的抗鼠CD3抗体4℃反应30分钟。用流式细胞仪分析两部分的B细胞和T细胞的纯度大于95％。