- 1、本文档共24页,可阅读全部内容。
- 2、有哪些信誉好的足球投注网站(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
中草药膜荚黄芪根部多糖免疫受体研究
文献翻译 妍妍 中草药膜荚黄芪根部多糖免疫受体研究 摘要:草药膜荚黄芪根部的免疫增强作用与它的多糖部分,即黄芪多糖(APS)密切相关,我们再此通过检测细胞增殖和细胞因子产量证明APS能激活鼠的B细胞和巨噬细胞,而不能激活T细胞。通过流式细胞检测分析及共聚焦激光扫描显微镜检测发现,荧光标记的APS(FL-APS)能够选择性侵染鼠的B细胞、巨噬细胞及人的肿瘤细胞系THP-1(单核白血病细胞)。这种与B细胞、巨噬细胞特异性的结合可被细菌脂多糖(LPS)竞争性地抑制。兔抗鼠免疫球蛋白抗体(Ig)能够抑制APS诱导的B细胞增殖和APS与B细胞结合。此外, APS能够有效刺激C3H/HeJ小鼠(其TLR4分子突变而无信号传导能力)脾脏B细胞增殖 ,上述结果表明,APS通过细胞表面不依赖TLR4而是通过免疫球蛋白来激活B细胞。有趣的是,APS对 C3H/HeJ小鼠巨噬细胞的刺激无反应,说明APS介导的激活巨噬细胞作用与TLR4密切相关。抗鼠TLR4单克隆抗体能够部分抑制APS与巨噬细胞的结合,提示APS与细胞表面的TLR4具有直接的相互作用。这些结果从分子水平揭示APS免疫作用机理。 材料和方法 动物和抗体 1、动物和抗体 试验动物:雌性BALB / c小鼠,购自北京大学健康科学实验动物中心;雌性C3H/HeJ小鼠,购自中国科学院上海实验动物中心。所有的动物均饲养于免疫教研室。 抗体:抗鼠TLR4或RP105单克隆抗体,购自Invivogen公司;鼠抗人CD14单克隆抗体购自R&D公司;兔抗鼠多抗和未免疫的兔或鼠IgG由本实验室制备。 2、黄芪多糖的制备 黄芪根切片,用沸水萃取三次。上清液加到用0-2 mol / L氯化钠线性梯度洗脱的DEAE-Sephacel中。碳水化合物组分浓度的测定采用苯酚 - 硫酸法。碳水化合物各组分混合,并且沉淀用酒精洗三次。产生的多糖提取物是针对水的几个变化透析的,然后冷冻干燥。最终产品的碳水化合物的含量为97%,提取的蛋白质和核酸污染可以忽略不计(在280和260nm处的吸光度值接近于零)。用凝胶过滤法测定提取物的分子量大约3500~1.58*10^6 。应用薄层色谱法和气相色谱分析糖成分表明,鼠李糖,木糖,葡萄糖,半乳糖,人,和FRU与鼠李糖:木糖:葡萄糖:半乳糖:人的摩尔比为:FRU?4.9:4.7:8.3:122.2:2.2:3.1。 3、细胞培养液 所有的细胞在R10的RPMI-1640培养液中培养(Hyclone公司),并添加10%(V / V)FCS(Hyclone公司)、青霉素/链霉素(100 U / ml)、L-谷氨酰胺(2mM)、和2-ME(5*10^5 M)。肿瘤细胞系的Raji细胞,THP-1,CCRF-CEM,来自于美国的ATCC,并在其实验室保存。 4、荧光标记的APS和葡聚糖的制备 基本上与Glabe 所描述的情况一致。简言之,APS或葡聚糖(分子量70,000,Sigma公司)的溶液(20mg/ml)与0.2毫克溴化氢(50mg/ml)和0.2M氢氧化钠混合,在PH11时磁力搅拌15分钟。在pH8.0时对钠硼酸盐缓冲液透析后20小时,经溴化氰活化的APS或葡聚糖与2mg荧光素胺(Sigma公司)体积小于4毫升混合10小时。合成的荧光标记的多糖经葡聚糖凝胶G-50(Pharmacia公司)的凝胶过滤柱(2*40厘米)与无荧光素胺分离。收集洗脱组分(3毫升/管)并且在440nm处波长处测荧光素胺的浓度。用含荧光素胺的梯度稀释液(从 2 到 200μM)制备标准曲线。用稀释后的葡聚糖构建标准曲线。 5、小鼠脾脏T细胞,B细胞,贴壁细胞和腹膜巨噬细胞的准备 BALB / c或C3H/HeJ小鼠的脾脏,轻轻按在不锈钢筛(200目)上用注射器柱塞捣碎。红细胞用蒸馏水短时间处理裂解,脾细胞洗涤两次,使之在完全R10中悬浮。 新鲜配制的、应用R10重悬为10^7个/ ml的BALB/c小鼠脾细胞接种到90毫米组织培养皿中,37℃、二氧化碳培养箱中培养4小时。收集没贴壁细胞用PBS洗两次,然后将涂有磁珠的CD19(B细胞表面抗原)大鼠抗小鼠的单克隆抗体,(Myltenyi BIOTEC)在密度为10μg抗体/10^7脾细胞中4℃培养30分钟。标记的细胞用PBS洗两次,然后用于磁珠分离柱,流出的非B细胞被收集。经过进一步清洗,移去磁选机,B细胞用柱塞冲洗。为了增加非B细胞内T细胞的纯度,重新用分离柱分离并收集T细胞(流出物)。B细胞与带有FITC标记的抗鼠免疫球蛋白抗体(IgG)、T细胞与带有的FITC标记的抗鼠CD3抗体4℃反应30分钟。用流式细胞仪分析两部分的B细胞和T细胞的纯度大于95%。
文档评论(0)