尿液样品代谢产物提取.docxVIP

新一代靶向代谢组学测试尿样代谢产物提取方法实验背景和目的代谢(Metabolism)是维持生物体功能进行的各类生化反应的总称。代谢产物(Metabolites)是参与生物体内代谢的小分子化合物，其分子量一般在1200Da以下。代谢产物具有非常重要的功能，是基因、蛋白与环境作用的直接反应。新一代靶向代谢组学技术 (Next-generation Targeted Metabolomics) 是近几年随着检测仪器的更新，刚刚发展起来的代谢组学新技术，旨在测定生物体内所有小分子的代谢产物的绝对浓度，了解其在疾病 (Diseases)、胁迫 (Stresses)等条件下的变化，进而揭示表观现象后的分子机制。尿液 (Urine) 是生物体代谢后，经过肾脏过滤，排除体外的“废物”。尿液中含有丰富的代谢产物，对于研究生物体代谢意义重大。尿液是临床上评估疾病，特别是肾脏相关疾病的主要手段之一。另外，尿里的一些代谢产物，也是癌症等重大疾病的标志物。尿液取样非常方便，对生物体没有损害，是代谢组学最常用的样品之一。实验需要准备的材料和器材提取液 (甲醇-乙腈 (50:50, V/V)和13C 稳定同位素内标物，提前放置-20 oC 冰箱预冷) ；碎冰或者冰盒涡旋仪低温高速离心机（提前置于4 oC 预冷）SpeedVac/lyophilize或者氮吹干，或者在通风厨挥干移液枪、枪头、离心管、Marker笔、手套等实验动物代谢笼1.5 ml 离心管、50 ml 离心管渗透浓度仪（测定尿液的渗透浓度 Osmolality）新一代靶向代谢组学测试尿液代谢产物提取方法（整个步骤需要大约40分钟）[1] 对于实验动物，采用代谢笼收集动物尿液，对于人，可使用50 毫升离心管收集尿液。动物尿液收集，一般是以4小时为间隔，比如0-4小时等。动物尿液样品，至少需要每组8个平行，人类的尿液，至少需要20个平行。[2] 利用渗透浓度仪，测定尿液的渗透浓度 (Osmolality)。此步骤非常重要，因为渗透浓度与代谢产物的浓度呈正相关，需要最后数据分析时候进行校正。如果条件不允许，可保留尿样于离心管中，以后测定。[4]取尿液，用生理盐水(0.9% NaCl)稀释100倍。如取10微升，加入990微升生理盐水，混匀为100倍稀释后的尿液。此步骤根据具体测试仪器的灵敏度，可以省去。此步骤对老鼠尿液非常重要，因为老鼠尿液的高度浓缩，需要进行稀释后，才能测定，否则会损坏仪器检测器。[5] 取100 微升稀释后的尿样，转移到1.5微升离心管中。[6] 加入400 微升提前预冷的提取液 (样品和提取液的体积比为 1:4，含13C稳定同位素内标物) ，涡旋混匀。如果尿液不够，或者为节约试剂，也可按照比例缩减，如：50 微升样品加200 微升提取液提取液。特别是老鼠尿液，有时候不够的话，可采取缩减的方法制备。平行一次操作，可制备24个样品（根据离心机的转子孔数），其他样品最好是放到冰上，如果确实需要很长时间(2h)，可将剩余样品冻存。[7] 在冰上静置10分钟，使提取液和尿液充分反应，可偶尔涡旋。这一步是为了裂解细胞、沉淀蛋白、DNA等大分子物质。[8] 高速离心 (16000 g, 4 oC) ，10 分钟，管上清液为小分子代谢产物。管底沉淀为DNA 和蛋白等大分子物质，如果尿液过稀，可能沉淀不明显，需要特殊注意，避免移液枪头接触到管底。离心速度至少要在10000 g 以上。[9]取上清液，到新的离心管中，在氮气下吹干，供分析测试用。取样时，小心不要取到底部的沉淀。特别是稀释后的尿样，沉淀可能不容易观察到。不用取出所有的上清液，如果是总体积为500微升，取200微升到新管吹干即可，剩余的上清液，可转移到另一个离心管中，保存在-80 oC 冰箱，作为备份。代谢产物在甲醇沉淀蛋白，去除酶以后，特别是吹干后，绝大部分是非常稳定的。可在室温下放置大约1个月的时间，没有显著的变化，这样方便运输。在移交之前可暂时放在-80 oC 冰箱。[9]做好编号，移交样品时，将样品编号分组信息（电子版也可以），一并转移，确保编号能够准确的被其他工作人员识别。