分子生物学导论-分子生物学研究方法(3).pptVIP

第七节 核酸序列分析技术 第八节 转基因技术 第十节 蛋白组学及其研究技术 课程回顾 2. 双元载体系统 双元载体系统是指两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统，由于其T-DNA和Vir区在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移，故又称为反式载体。 一元载体(顺式载体) 双元载体(反式载体) 二、受体材料的选择 受体是指用于接受外源DNA的转化材料。 良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件： 1. 高效稳定的再生能力； 2. 受体材料要有较高的遗传稳定性； 3. 外植体来源方便，如胚和其它器官等； 4. 对筛选剂敏感； 5. 转化率高。 常用的受体材料有以下几大类型: 1. 愈伤组织再生系统 外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化(带有目的基因质粒的农杆菌侵染)，分化培养获得再生植株。 优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因， 转化效率高。 缺点：遗传稳定性差、嵌合体 因此需要连续的再生系统 2. 直接分化再生系统 外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。 优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。 3. 原生质体再生系统 原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。 4. 胚状体再生系统 是指具有胚胎性质的个体。 优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强， 嵌合体少，易于培养、再生。 缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。 5. 生殖细胞受体系统 以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。 一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统； 二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。 三、植物遗传转化体系 （一）载体型遗传转化系统 最常见的转基因方法。 将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。 农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒(root-indcing?plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。 农杆菌共培养侵染 诱导愈伤组织 分化生芽 生根 叶盘转化法 (1)叶盘法 双子叶植物较为常用、简单有效的方法。 (2) 真空渗入法 将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下，发生遗传转化。该法简便、快速、可靠，不需要组织培养。 (3) 愈伤组织共培养 (4) 原生质体共培养 （二）DNA直接转化系统 1. 化学刺激法 细胞融合剂：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC） 转化顺利，对细胞伤害小； 避免嵌合体的生成； 易于选择； 便于进行理论研究； 受体广泛。 优点： 将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达。 步骤简单易行：适合于大多数细胞或组织，克服了受体材料的限制，不必制备原生质体，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。 2. 基因枪轰击法 （微弹轰击技术micro-projectile bombardment) 3. 高压电穿孔法 电击法 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － － － 利用高压脉冲作用，在原生质体上形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。 4. 微注射法 细胞操作： 利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方式将受体细胞（原生质体或生殖细胞）固定，然后将供体DNA或RNA直接注射进入受体细胞。 子房注射法或花粉管通道法： 具有较大子房或胚囊的植株可在田间进行活体操作。操作简便、成本低。 四、转化体的筛选和鉴定 1. 转化体的筛选 外源目的基因转化频率低 目的基因已被整合到核基因组并表达转化细胞更少 使用特异性选择标记基因（selectable marker genes）进行标记，有效地选择出真