蓝塘猪和大白猪肌肉组织mRNA差异表达分析研究.pdfVIP

摘 要 猪生长和肉质性状是重要的经济性状，受微效多基因控制，并且可能存在一个 或数个主效基因的影响。随着动物基因组计划的深入开展和分子标记技术的发展， 己经发现了许多影响猪生长和肉质性状的QTL和相关基因。中国地方猪种和外国引 进猪种在肌肉生长和猪肉品质性状上表现出明显的表型差异。为了研究中外猪种这 种表型差异的原因，并且寻找可能与猪生长和肉质性状相关的基因，本研究利用 mRNA差异显示技术对)、一东地方品种蓝塘猪和引进品种大白猪成年猪眼肌组织 mRNA进行比较分析，并运用生物信息学技术对新发现的一条表达序列标签 (ESTsp3)序列进行了深入的分析，主要结果如下: l,通过对影响差异显示技术的各种实验条件 (包括总RNA投放量、PCR退火 温度、镁离子和dNTPs浓度、差异显示引物、差异带检测方法、银染显色条件等) 的试验，在本实验室建立并优化了一套切实可行的银染mRNA差异显示技术。 2,应用银染mRNA差异显示技术，采用30种引物对组合 ((3种锚定引物和10 种随机引物)检测了蓝塘猪和大白猪眼肌组织近2000条cDNA片段，分离得到在 两品种中存在差异表达的6个猪肌肉组织ESTs(ESTspl,ESTsp2,ESTsp3,ESTsp4, ESTsp5和ESTsp6),6条差异显示的EST中有4条在蓝塘猪中表达量比大白猪高， 其它两条在大白猪中表达量比蓝墉猪高。 3、将得到的差异片段克隆进质粒，经PCR鉴定的阳性克隆质粒由上海博亚公 司测序，测序结果显示:6个EST片段的长度范围在lllbp-372bp之间，平均大小 为198bp。其序列被GenBank收录，登录号为CB274875-CB274880, 4、登录美国国家生物信息中心 (NCBI)网站，用BLAST软件将得到的序列 与GenBank中的序列进行同源性比对，发现在6个ESTs中，有3个ESTs(ESTspl, ESTsp2,ESTsp6)与己知序列无同源性;ESTsp3与人CAV1(Homosapienscaveolin 1)同源，ESTsp4与小w蛋氨酸类氨基肤酶1基因(methionineaminopeptidase-likel gene)同源，ESTsp5与猪的IGF:前处理蛋白基因(insulin-like-growthfactor2 preproproteingenes)]司裤。 5、用电脑克隆技术对ESTsp3进行了有效延仲，得到786bp的序列。经开放阅 读框架 (ORF)分析表明其含有一个83aa的完菜开放阅读框架。根据电子延伸序列 设计两条引物MPI和MP2，用RTPCR方法对延伸序列进行了验证，结果表明，延 仲序列是正确的。电子表达谱分析表明ESTsp3在皮肤、骨骼肌、肾等多种组织和 细胞中表达。 关键词:猪 肉质 mRNA差异显示 EST 生物信息学 缩 略 词 表 缩略词 英文全称 中文全称 Ap ammoniumpersulsate 过硫酸钱 ARPP cAMPregulatedphosphoprotein cAMP一调控磷蛋白 CSTB cystatinB 半胧氨酸蛋白酶抑制剂B CTSB cathepsinB 组织蛋白酶B DD mRNAdifferentialdisplay mRNA差异显示 DEPC diepthylpyrocarbonate 焦磷酸二乙酷 DTT dithiothreitol 二硫苏糖醇 EDTA sodiumethllenediaminetetraaceticacid 乙二胺四乙酸二钠 EST expressedsequencetag 表达序列标签 FSH follicularstimulatinghormone 乡0泡刺激素 GH growthh