蓝细菌谷氧还蛋白的表征及其目标蛋白的鉴定研究.pdfVIP

生物技术 蓝细菌谷氧还蛋白的表征及其目标蛋白的鉴定奉 李民吴庆余 清华大学生物科学与技术系，北京，100084 摘要谷氧还蛋白是一种作用广泛的巯基转移酶，能够还原蛋白分子间二硫键以调节细胞内氧化 达到纯度95％．蛋白催化≯i}【化物比活力为41．5 U／mg，具有较高的热稳定性，点突变结果表明 保守位点的N端半胱氨酸为关键位点．体内试验表明谷氧还蛋白能提高大肠杆菌和蓝细菌的抗 氧化能力。构建突变蛋白作为亲和配基钓取蓝细菌6803胞内相互作用蛋白．经LC—MS／MS鉴定 共有42个目标蛋白，分别属于胁迫响应、卡尔文循环、蛋白质合成和折叠等12中细胞过程。 这表明谷氧还蛋白在维持细胞内氧化还原态势方面有广泛而重要调节作用． 关键词生物化学与分子生物学；谷氧还蛋白；氧化还原平衡；蓝细菌Synechocysitssp．PCC 6803 引 言 生物体中的氧化还原系统主要是由一些富含半胱氨酸残基的蛋白质组成，这些蛋白可以在活性位点和 对应二硫化物的半胱氨酸之间快速进行可逆的巯基(．SH)和二硫键(…SS)交换反应。通过这种交换来调节细 胞内的氧化还原态势，从而实现蛋白功能的调控【ll。二硫键的可逆还原反应主要通过一系列含．CXXC一功能 区为活性位点的巯基氧化还原酶介导完成。胞内负责胞内二硫化物的还原主要有硫氧还蛋白系统 (Thioredoxin system)和谷氧还蛋白系统(Glutaredoxin 等在缺失硫氧还蛋白(TⅨ)的大肠杆菌中作为核糖核苷酸还原酶(RNR)的巯基氢供体首次发现【引。在谷 胱甘肽还原酶催化并依赖谷胱甘肽的脱氧核苷酸合成中行使电子载体的作用。谷氧还蛋白一般含有100个 左右氨基酸残基，其活性位点很保守为YCP(Y／F)C，具有谷胱甘肽结合位点。现已在许多生物体中发现具 有不同结构和催化性质的的异构体【51。在谷氧还蛋白系统中电子从NADPH传递到谷胱甘肽还原酶，然后 到谷胱甘肽，最后传递到Grx(图1)。 Pill-s， ：萸：X 陬秸叫s嘞 删叉一人 图1谷氧还蛋白普遍作用机制 谷氧还蛋白通过双巯基机制催化蛋白分子内二硫键，通过单巯基机制催化谷胱甘肽一蛋白混合二硫化 是底物本身，使单巯基机制的去谷胱甘肽化作用成为一种更普遍的谷氧还蛋白功能。蛋白谷胱甘肽化作用 能够可逆调节含巯基蛋白的功能已成为生化过程中一种越来越重要的调节机制【8J。Grx在细胞内行使多种 生物学功能，包括体内抗氧化胁迫、调节转录因子、还原脱氢抗坏血酸、抑制细胞凋亡、参与硫代谢等过 程【9，1们。 谷氧还蛋白已在许多生物体中发现，包括病毒(噬菌体T4、牛痘、HIV病毒等)、大肠杆菌、酵母、 2】。但是在藻类相关功能和结构研究 植物【ll】(水稻、菠菜、杨树等)以及哺乳动物(兔、牛、猪、人等)【l ’国家自然科学基金重点支持项目，项目编号 中国科协第四届优秀博士生学术年会论文集 31。根据序列比对， 未有相关报道。Synechocystissp．PCC6803(蓝细菌6803)基因组测定己在1996年完成【l 我们发现有3种可能的谷氧还蛋白基因。本文首次克隆表达了其中的ssr2061，并进行了性质鉴定。采用 胁迫响应、光合呼吸、能量代谢等细胞过程。其中部分目标蛋白与植物【141中已鉴定的有较高重叠，但仍有 26种从未报道。这说明谷氧还蛋白在藻类和植物中具既有相似的功能也存在更多不同。另外这这些广泛的 作用目标点也表明谷氧还蛋白在胞内行使着重要的氧化还原调节作用。 1试验材料与方法 1．1试验材料 的Sepharose 甘肽还原酶(GR)购于Sigma公司。其他试剂均为