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中国工程热物理学会 传热传质学 学术会泌论文 编号：073455 胞内冰晶生长研究 杨戈尔 张爱丽徐学敏 (上海交通大学生物传热传质实验室，上海，200240) (Zhangaili@sjtu．edu．cn) 摘要：细胞在冷冻过程中的胞内冰晶形成和生长研究，对于低温手术和低温保存的广泛应用非常 重要。本文实验研究_『胞内冰晶在血管内皮细胞中的形成和生长瞬间，并比较了在不同降温速率下胞 内冰品的形态差异。 关键词：胞内冰晶： 生长： 形态差异 1介绍 在冷冻过程中，直接细胞损伤是造成细胞死亡的最显著原因【1】。当降温速率较慢时， 细胞外首先出现冰晶，胞外溶液浓度逐步升高，促使胞内水分通过细胞膜，向外渗出，， 细胞即产生脱水；当降温速率较快时，细胞内部水分米不及外渗，就会出现胞内冰品【2’3J， 对细胞膜和细胞器造成破坏。相比于细胞脱水，胞内冰晶的形成对于细胞而言通常是致 命的。因此研究胞内冰晶形成和生长规律对予低温技术在细胞保存、肿瘤治疗上的广泛 应用至关重要。 然而目前学者尚未在胞内冰晶形成机理上形成统一观点，特别是胞内冰晶的生氏特 镜扫描的技术，发现了在快速冷冻下，纽胞核和细胞质内的冰品大小存在差异【4】。在核 膜两侧有一个冰品大小的突变，核内的冰晶要犬于细胞质的。依此他们推测了冰晶在胞 内的生长方向：只有胞内冰晶从细胞膜往细胞核生长，才能出现这种现象。但没有直接 个过程15J。他们用了人体内最大的单个细胞，但是拍摄速度不够，忽略了大量信息，只 能说明胞内冰晶是从膜上某个位置出发，向胞内生氏。所以如果能够在观测和成像技术 有较大改进，那么就可以进一步找到这些丢失的信息，确定胞内冰晶的生艮疗向和其他 生长规律。为此，本文借助高速CCD，对血管内皮细胞在冷冻过程中胞内冰晶形成和 生长规律进行了一系列的实验研究，获得了一些未知的信息。 2材料和方法 2．1细胞培养 采用Medium 200营养液，将人脐静脉内皮细胞培养r37℃、5％C0：的培养箱中。 实验前，胰酶消化细胞，将得到的悬浮液以1x103个／毫升的细胞密度接种于直径为14mm 的玻片，培养火约72小时后用丁：实验。 2．2冷冻与复温过程 采州BCS196冷台及其自带软f，}：控制细胞冷冻和复温过拌，jf实时i己录样品的温度 1024 温至常温。 2．3成像技术与图像处理 将铺有细胞的玻片放入冷台j并置于显微镜载物台，利用蔡司显微镜，(zeiss，LsM 510 Cooke ME-IA)和高速CCD(the 程，以及冰晶和细胞的形态变化。其中，高速CCD成像系统包括摄像头和外置电源， ProPlus6．O(IPP 的图像数据采用Image 6．O)图像处理软件进行处理和定量计算。 3结果和讨论 3．1胞内冰晶形成和生长过程 图1胞内冰晶形成和生长过程 ．将所记录的图像序列输入IPP6．0，截取包含较为清晰的冰品生长过程的区域，如图 1所示。图1记录了冰晶在细胞内部生长的不同阶段：细胞接种冰晶后(图1a)，以60 ℃／min的速率降温；在一17．6℃，胞内冰晶最先出现予细胞膜上靠近细胞核处(图1b)； 随着温度降低，冰晶在细胞质内生长至细胞核膜上(图1c)；之后，冰品通过核膜在细 胞核内生长并迅速铺满核内空间(图1d和图1e)；到达核边缘后，冰晶再次进入胞质(图 l轨大约距形成0．7秒后，胞内冰晶停ll==生长。 在大量重复实验中，我们记录了人约300个存在类似冰晶生长过程的细胞，所观察 到的胞内冰晶总是从细胞膜上产生，在细胞质中生长，然后透过核膜进入细胞核，最后 同到细胞质，这与J．C．Bi|schof等人的预测结果一致14Jo 1025 图3胞内冰晶生