Fit-1胞外Ⅲ区蛋白的可溶性表达、纯化及活性测定.pdfVIP

生 物 工 程 学 报 ChinJBiotech2009，April25；25(4)：580-586 journals．im．ac．crl ChineseJournalofBiotechnology ISSN 1000-3061 cjb@irn．ac．on @ 2009InstituteofMicrobiology,CASCSM,Allrightsresewed Fit．1胞外Ⅲ区蛋白的可溶性表达、纯化及活性测定 谢印良，谷岳 ，黄蕊 ，李雪霞 ，杜雪 ，王金宏 ，熊冬生 ，杨纯正 ，许元富 1中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院 实验血液学国家重点实验室，天津 300020 2天津医科大学总医院，天津 300020 摘 要：本研究 旨在克隆和表达人血管 内皮生长因子受体一1胞外III区蛋 白，并测定其生物学活性。应用 RT-PCR法从人 脐静脉内皮细胞 中克隆 f．1胞外III区基 因片段，经测序鉴定后再克隆到原核表达载体 pAYZ 中，构建出的表达载体 pAYZflt一1HI转化大肠杆菌 16C9后，用低磷培养基诱导表达 目的蛋 白；采用 E．tag亲和层析柱纯化 目的蛋 白；用 SDS—PAGE、Westernblotting和 BCA法对其进行定性 、定量检测鉴定；用 ELISA、损伤愈合试验和Transwell法检测靶 蛋白生物学活性。克隆的 f一1胞外III区基因经测序鉴定正确。所构建的pAflt一1III表达载体经低磷培养基诱导后高表达 出可溶性Fit一1胞外IⅡ区蛋白，产量约为 1．1mg／L；ELISA结果显示该蛋白可以结合 VEGFl65，并表现为剂量依赖性，其 与配体结合的解离常数 为 1．180pmol／L。损伤愈合试验和 Transwell结果显示该蛋白可以抑制 VEGF165(50ng／m1)和 bFGF(100ng／mL)诱导的脐静脉内皮细胞的迁移，并呈剂量依赖性。这将为今后开展人fit一1基 因III区的功能研究及其单 抗研制奠定了实验基础 。 关键词：血管 内皮生长因子受体 1，血管新生，血管 内皮生长 因子 165 Solubleexpprreesssslioonn，，Ppuurriiftiicationandi1aczutivvlittyyaannaahlystsot“ extracellulardomainIIIofFltl YinliangXielYueGu，RuiHuang ，XuexiaLi，XueDu，JinhongW ang，DongshengXiong， ， ChunzhengYang ，andYuanfuXu 1TheStateKeyLaboratoryofExperimentalHematology，InstituteofHematology，ChineseAcademyofMedicalSciences＆PekingUnionMeScal College，Tianjin300020，China 2TianjinMedicalfniversityGeneralHospital，Tianjin300020，China Abstract：ToprepareasolublehumanextracellularIIIdomainofF1tlandnaalyzeitsbiologicalactivity．Thegeneencoding extracellulardomainIIIofFit一1wasclonedintotheexpressionvectorpAZYbvRT-PCR from humanumbilicalveinendothelial cell (HUVEC)，nadinducedtoexpressinEscherichiacolibylowphosphoricmedium，theproductwaspurifiedbyE·tagaffmity chromatography．SDS—PAGEandWestern blottingna alysisshowedthatFit一1genedomainIIIgenewasexpressedinE colinadhte yieldofthesolublefusionproteinwasabout1．10mg／L．Enzyme—LinkedImm