放射免疫-荧光标记免疫.pptVIP

;免疫分析技术的发展;免疫标记技术=;检测方法 ;标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。 免疫技术：以抗原-抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。 标记免疫分析：是利用多种标记技术与免疫技术相结合而建立的测定技术体系。其核心即是高灵敏性和高度特异性的有机结合。 ;常见免疫标记技术; 放射免疫技术分类; Ag;抗原标准品与待测抗原 结构---完全相同/结构相似且亲和力相近 纯度---纯度90%以上（免疫纯） 较高的放射比 放射性同位素 特异性抗体 特异性高、亲和力高（Ka）、效价高 。“三高”！;标记核素;氯胺-T 法：最常用的 125I 标记法，125I 与酪氨酸共价结方法简便，但易造成蛋白质的损伤 乳过氧化酶法（LPO）：标记方法更温和，对被标记物的生物活性影响 ;125I -标记物的鉴定; 游离抗原与免疫复合物的分离;测量、数据处理;; 1.3 放射免疫技术基本类型;免疫放射分析技术（immunoradiometric assay，IRMA）;2.1 免疫放射技术基本条件;2.2 免疫放射技术基本类型; 双抗夹心法;放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好, 常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足, RIA将逐渐被取代。;荧光免疫技术 Immunofluorescence technique， IFA;Introduction:;荧光素具有共轭双键体系的化学结构 通常处于最低能量状态---基态 激发光（紫外光）照射，跃迁到激发态 回到基态，释放光子能量（波长较长的可见光 ---荧光）; 荧光免疫分析（IFA）技术原理; 一种有机或无机化学物质，其接受激发光后，能够以发射光形式产生明亮的荧光而作为染料使用。 各种荧光素都有各自的激发波长和发射波长。因发 射波长不同而颜色不同。 异硫氰酸荧光黄（FITC），四乙基罗丹明（Rb200），藻红蛋白（PE）。;较高较稳定的荧光效率 具有能与蛋白质分子形成稳定共价键的化学基团 与蛋白质结合简单快速 结合产物的荧光颜色与实验对象的自发荧光对比鲜明 结合物具有一定的耐贮藏性;抗体：特异性强、效价高、标记后活性高 标记前：梅花状双扩测效价 标记抗体种类：多克隆抗体、单克隆抗体、葡萄球菌A蛋白（荧光二抗通用试剂）; FITC（ 异硫氰酸荧光黄）标记抗体Marsshall法原理 当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸-氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。;; 4. 荧光标记抗体鉴定; 经典荧光抗体染色法;流式细胞仪（Flow Cytometor, FCM），以荧光免疫技术为基础发展起来的专门的细胞分析技术。是一项集液流喷射技术、激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的检测仪器。;1. 流动室及液流驱动系统 2. 激光光源及光束形成系统 3. 光学系统 4. 信号检测与存贮、显示、分析系统 5. 细胞分选系统 ;荧光染色的细胞（微粒）悬液标本;若干组透镜、滤光片、小孔 ---将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器; 单细胞分析：任何单细胞悬液，如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞，实体组织经处理后制成单细胞悬液。 快速分析：极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。;多参数分析：可同时分析单个细胞的多种特征,当同时用多种分子探针,如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色,通过流式细胞分析,即可获得单细胞的多种信息,使细胞亚群的识别、计数等更为准确。 定性或定量分析：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。 ;1979年，芬兰Wallac公司研发部的Soini和Hemmila首次建立稀土离子标记物的“时间分辨荧光免疫技术分析”理论；1984年，Hemmila确定了DELFIA免疫荧光技术方案，从而使DELFIA成为Wallac的专利技术。1989年该技术获诺贝尔化学奖提名。 90年代以来，时间分辨荧光技术因其灵敏度高，操作简便，标准曲线范围宽，不受样品自然荧光干扰，无放射性污染等特点，其方法学研究和临床应用的发展十分迅速。 目前，时间分辨免疫荧光技术正成为现代医学研究中最有发展的研究手段之一。;示踪剂：三价稀土离子包括有铕（Eu），钐（Sm），镝（Dy）等