基因工程与应用20091026.ppt

构建转移载体 杆状病毒的基因组太大，不能直接插入外源基因。 必须使用同源重组的办法。 转移载体 2. 杆状病毒载体转化过程 ① 转移载体中插入外源基因 ② 转移载体与野生型AcMNPV DNA共同 转染宿主细胞 转移载体与病毒基因组发生双交换，外 源基因被交换转入病毒基因组中， ④ 重组病毒侵染宿主4-5天后即可收获重组 蛋白 3. 筛选 由于多角体基因被取代,不能形成多角体, 通过病毒空斑测定就可识别阳性克隆 4. 常见的宿主细胞 秋粘虫S .f rugiperda 卵巢组织的细胞系sf29 家蚕细胞系 粉纹夜蛾Trichoplusia ni 脂肪体的传代细胞系HNU2Tn2FB1 5.杆状病毒大规模表达存在的问题 （1）寿命短 感染4-5天后宿主细胞裂解或幼虫死亡。 （2）共同转染率低 重组率更低。0.1%-1%。 6.昆虫表达系统的进展 改进病毒载体 NPV DNA 线性化,体外定点酶促重组 酵母-昆虫细胞和大肠杆菌-昆虫细胞的穿梭载体的开发 如：BacPAK6 的重组效率高达80 %以上 建立高效表达细胞系 1. 表达载体 病毒载体：腺病毒（AV）、腺相关病毒(AAV) 逆转录病毒(RV)、痘苗病毒（VV) 单纯疱疹病毒（HSV) 人免疫缺陷病毒（HIV)等 质粒载体： （四）在哺乳动物细胞中表达 （1）病毒载体构建 （1）去除病毒的致病性结构的基因序列如逆转 录病毒的gag、pol、env基因，从结构上保证病毒的安全性。同时产生的空白区以目的基因取而代之； （2）保留其基因的调控序列及包装序列等； （3）插入标记基因如NeoR基因以对基因转染细胞的抗性筛选等。 Vector DNA Helper DNA Engineering a Virus into a Vector wildtype virus Viral vector Based on Kay et al 2001 replication proteins structural proteins Packaging Therapeutic gene essential viral genes Packaging cell Y vector Vector uncoating Therapeutic mRNA and protein Episomal vector Integrated expression cassette Target cell Gene Transfer Based on Kay et al 2001 （2）质粒载体 一个高活性的启动子：如pCMV 转录终止序列和polyA加尾 在宿主细胞中复制或增殖的序列 真核细胞筛选标志（neo） 原核抗性筛选标志（ampr） 原核复制起始点序列 标签蛋白基因：如GFP、GST等 pcDNA3 Invitrogen Corporation pcDNA3.1CAT pEGFP-C2 MCS EGFP SV40 poly A SV40 origin neomycin/kanamycin resistance gene pUC origin 2. 宿主细胞 ＣＯＳ 细胞 骨髓瘤细胞株 ＣＨＯ 细胞 ２９３ 细胞 3. 外源基因导入方法 　生化方法转染 　　磷酸钙、ＤＥＡＥ－葡萄糖、脂质体 　物理方法转染 　　生物粒子导入、微注射、电穿孔 　病毒介导的转化 4. 表达方式 瞬时表达：指宿主细胞在导入表达载体后 不经选择培养，载体ＤＮＡ随 细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋 白的表达时限短暂 稳定表达：载体进入宿主细胞并经选择培 养，载体ＤＮＡ 稳定存在于细 胞内，目的蛋白的表达持久稳定 第三节 基因工程的应用 一、在医学上的应用 1. 基因工程药物 采用基因工程（DNA重组)技术，生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、抗体和细胞生长因子类药物，也包括反义药物和基因药物。 基因工程药物的种类 ① 重组蛋白质或多肽类药物 胰岛素、生长因子、小分子抗体、 乙型肝炎表面抗原 ② 反义寡核苷酸类药物 反义DNA、反义RNA、核酶 ③ 基因药物——DNA药物 基因工程药物的发展 基因工程药物自1982年